Réaction en chaîne par polymérase - Définition

Techniques associées à la PCR

Les sigles et les noms en anglais sont donnés entre parenthèses.

PCR multiplexe

La PCR multiplexe (multiplex PCR) est un protocole destiné à amplifier plus d’un amplicon à la fois, par l'utilisation d'au moins trois amorces par réaction de PCR. Les produits de PCR ne seront alors compétitifs que pour la polymérase, les dNTP et, éventuellement, le marqueur d’ADN. Il est également possible d’amplifier différents types d’ADN reconnus par un même couple d’amorces, tels les mimics. La PCR multiplexe peut se faire en point final (les produits de PCR étant usuellement différenciés par leur taille ou la présence d’un site de restriction) ou en temps réel (chaque produit étant mesuré par une sonde spécifique couplée à un fluorophore dont le spectre d’émission est différent des autres). Ses applications qualitatives sont nombreuses (détection de souche virale, de mutations, …) mais son aspect quantitatif ne fait pas l’unanimité, malgré de fortes pressions industrielles pour ce marché très lucratif.

Méta-PCR

Meta-PCR est une méthode qui permet de donner une molécule d'ADN synthétique comprenant n'importe quelle combinaison d'ADN amplifiable par PCR dans n'importe quel ordre. Elle est effectuée dans un seul tube et se compose de deux différentes étapes de la PCR séparées par un cycle de dégel pour éliminer l'activité résiduelle de la polymérase. La Meta-PCR peut être utilisée pour accroître le débit des méthodes de numérisation et balayage des mutations.

PCR emboîtée ou Nested PCR

La PCR emboîtée, PCR gigogne ou PCR nichée (Nested PCR) est une PCR en deux étapes successives, avec deux couples d’amorce différents, le second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon. Cette technique était initialement utilisée pour réduire le risque de contamination (le produit final devait pouvoir interagir avec deux couples d’amorces, donc deux niveaux de spécificité). Elle est maintenant très utilisée par les virologues travaillant sur les virus à ARN qui peuvent avoir une haute mutabilité. Le premier couple d’amorces est conçu pour pouvoir accrocher les quelques parties stables du génome viral, le deuxième pour identifier le sous-type. Elle permet aussi une meilleure sensibilité du résultat.

PCR asymétrique

C'est l'amplification par PCR en présence d'une faible quantité d'une des amorces. Elle permet le séquençage direct des fragments amplifiés. Pendant les 20 à 25 premiers cycles, l'ADN double brin est généré, jusqu'à épuisement de l'amorce limitante et de l'ADN simple brin est produit pendant les 5 à 10 derniers cycles. Les rapports d'amorces utilisés sont de 50 pmole/1-5 pmoles/100 µL (1-3 pmoles simple brin après 30 cycles).

PCR à asymétrique thermique entrelacée

La PCR à asymétrique thermique entrelacée (TAIL-PCR ou Thermal asymmetric interlaced PCR) est un protocole complexe alliant les principes de la PCR emboîtée, de la PCR asymétrique par le Tm des amorces, la succession de plusieurs types de cycle favorisant l’hybridation de telle ou telle amorce, et des amorces dégénérées. Le but est d’obtenir un amplicon final spécifique d’une séquence d’ADN dont seule une extrémité est connue généralement dans l’optique de séquencer la partie inconnue. Cette méthode est très utilisée pour la marche sur chromosome ou la caractérisation des séquences variables des immunoglobulines.

PCR en gradient de température

Il s’agit d’une technique aidant à la mise au point d’un nouveau protocole de PCR. Elle nécessite des thermocycleurs capables d’assurer des températures différentes, pour une même étape, aux différents échantillons. Elle est surtout utilisée pour optimiser l’étape d’hybridation, notamment en PCR multiplexe.

Les PCR quantitative

PCR semi-quantitative

La PCR semi-quantitative est basée sur l'interruption de la PCR en plusieurs cycles qui correspondent à la phase stationnaire (la quantité d'ADN augmente très doucement car il y a peu d'ADN matrice), la phase exponentielle (croissance rapide) et au plateau (diminution de la quantité de réactifs). Pour un échantillon, il est possible d'estimer la quantité initiale d'ADN si l'on dispose d'un échantillon où la quantité d'ADN est connue (étalon). Leur amplification par PCR, l'arrêt de la réaction entre le 20e et le 30e cycle PCR et la comparaison entre les intensités lumineuses des produits PCR marqués au BET permettent d'estimer la quantité initiale d'ADN. Pour deux échantillons, il est possible de comparer leur quantité d'ADN initiale en arrêtant la PCR avant le plateau de la PCR (<30 cycles).

PCR en temps réel ou PCR quantitative

La PCR en temps réel (Real-time PCR) est une révolution dans l’utilisation de la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l'appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR), on préférera donc les appellations PCR quantitative ou qPCR. Certaines expériences en PCR compétitive ou PCR radioactive permettent l'obtention de mesure quantitative exploitable.^{[réf. souhaitée]}

PCR en point final

La PCR en point final (end point PCR) est un terme qui est apparu en opposition à la PCR en temps réel. Il désigne toutes les tentatives de quantification à partir du produit final d’une réaction de PCR.

PCR par essais

La PCR par essais (Touchdown PCR) est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produits de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intérêt devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais.

PCR sur colonie

La PCR sur colonie (Colony PCR) est un protocole qui permet d'amplifier de façon simple de l'ADN de micro-organisme (bactéries, archées ou levures) en inoculant directement la colonie dans le milieu réactionnel de la PCR. Durant les premières étapes de dénaturation, les cellules sont lysées et leur ADN est libéré dans le milieu réactionnel. L'ADN ainsi libéré peut alors servir de matrice.

La PCR sur colonie est utilisée notamment pour vérifier l'efficacité d'une transgénèse. Elle fut très utilisée lors de la construction des BAC dans les grands programmes de séquençage.

La PCR sur colonie est largement utilisée en recherche microbiologique afin de caractériser sur le plan phylogénétique les souches étudiées.

Après transcription inverse

RT-PCR

La (Reverse Transcriptase PCR) est une technique qui associe une transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un ARN avec des désoxyribonucléotides en utilisant une ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être amplifié par PCR (l'ADNc étant plus stable, il permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes).

RT-PCR en une étape

La RT-PCR en une étape (single step RT-PCR) est un protocole mélangeant les réactifs de RT et de PCR afin que les deux étapes puissent se faire sans avoir à ouvrir le tube. Cela permet de réduire le risque de contamination ou d’inversion d’échantillon mais il est plus difficile d’optimiser le milieu réactionnel pour chaque étape. Cela induit en outre un risque de biais pour normaliser l’étape de RT car cela implique d'utiliser la PCR multiplexe.

RT-PCR in situ

La RT-PCR in situ est une méthodologie consiste à réaliser la RT-PCR non pas sur des molécules en solution mais sur des coupes histologiques. Bien que les résultats ne soient que semi-quantitatifs, ils apportent en outre une information sur la localisation des transcrits dans le tissu.

RT-PCR quantitative

La RT-PCR quantitative (qRT-PCR) est une technique destinée à pouvoir quantifier un type d’ARN initialement présent dans un échantillon. Ce terme désigne l'utilisation de deux techniques successivement, une Transcription inverse suivie d’une PCR en temps réel. Objectif principal de la plupart des biologistes, elle soulève de vives polémiques quant à l’utilisation de calibrateur externe ou interne (gène de ménage). À l’exception de complexes protocoles utilisant des calibrateurs externes homologues compétitifs, elle ne permet qu’une quantification relative.

RT-PCR sur une cellule

La RT-PCR sur une cellule (single-cell RT-PCR) est une méthodologie qui permet d’étudier les transcrits d’une cellule unique, obtenue par patch-clamp, microdissection laser ou triage de cellules par activité de fluorescence (FACS en anglais pour Fluorescence activated cell sorting). Cette précision peut être nécessaire lorsque le tissu n’est pas homogène (cellules tumorales, feuillets cellulaires bien différenciés, etc.) mais la quantification va devenir moins précise à cause d’une amplification des effets stochastiques et nécessite donc une multiplication des mesures.

PAN-AC

Une autre technique d'amplification isotherme : "Polymérisation des Acides Nucléiques pour Apoptose Controlée". Les auteurs prétendent que cette technique pourrait être mise en œuvre dans des cellules vivantes, et ainsi soigner diverses pathologies (HIV, Malaria, cancers...) mais ces affirmations n'ont été corroborées par aucune autre équipe pour le moment.

TP-PCR

La TP-PCR (TP pour Triplet Repeat primed), une variante complexe de la PCR, a été mise au point par Jon Warner en 1996 et est utilisée dans les amplifications des gènes comportant des triplets répétés, comme dans le cas de la Dystrophie myotonique de Steinert. La combinaison PCR-Séquençage ne peut pas être utilisée dans ces cas car la Taq polymérase fait des erreurs de réplication.

Amplification hélicase-dépendante

L'amplification hélicase-dépendante (HDA ou helicase-dependent amplification) est une technique récente proche de la PCR, où la déshybridation induite par la température est assurée par une hélicase.