Électrophorèse - Définition

Introduction

Technicienne utilisant l'électrophorèse pour séparer des protéines.

L’électrophorèse est – avec la chromatographie – la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules. Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou celle des acides nucléiques. Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.

Description

La technique de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement d'ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.

Les molécules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molécules cationiques (+) se déplacent vers la cathode (−).

Sur les acides nucléiques, les charges sont portées par les groupements phosphate du squelette.

Sur les protéines, la situation est plus complexe et il existe différents types de groupements ionisables :

• Ceux pouvant acquérir une charge négative :
  • Les fonctions acide carboxylique (-COOH) de l'acide glutamique, de l'acide aspartique et de l'extrémité C-terminale de la chaîne polypeptidique ;
  • La fonction thiol (-SH) de la cystéine;
  • Les fonctions alcool (-OH) de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine.
• Ceux pouvant acquérir une charge positive :
  • La fonction guanido de arginine ;
  • La fonction imidazole de l'histidine ;
  • La fonction amine (-NH₂) de la lysine et de l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique ;

La charge nette d'une protéine dépend donc en général de sa composition en acides aminés et du pH.

Électrophorèse en veine liquide

Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de ce champ est constitué par un tampon de pH et de concentration convenables dont les ions conduisent le courant d'un pôle à un autre. Ce support peut être liquide : on parle alors d'électrophorèse en veine liquide (mise au point par Tiselius en 1937).

Électrophorèse de zones

Les principales applications utilisent un support poreux stabilisant la phase liquide : on parle alors d'électrophorèse sur support ou d'électrophorèse de zones. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, poreux et imprégné de tampon (papier, dérivés de cellulose, polyoside « agarose », polyacrylamide…). Le support doit être homogène, poreux et inerte. En fait, la condition d'inertie n'est jamais respectée et le support joue un rôle plus ou moins important dans la séparation.

Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de support :

• électrophorèse sur papier ;
• électrophorèse sur acétate de cellulose ;
• électrophorèse sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide…).

Il existe de nombreux types d'électrophorèses, dont :

• électrophorèse sur gel de polyacrylamide (ou PAGE pour Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) ;
• électrophorèse en gel d'agarose ;
• focalisation isoélectrique (électrophorèse dans un gradient de pH) ;
• électrophorèse bi-dimensionnelle ;
• électrophorèse en champ pulsé ;
• Immunoélectrophorèse (pour détecter une interaction antigène/anticorps) ;

Gel d'électrophorèse

En biochimie, l'électrophorèse en gel est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur.

Deux principaux polymères sont utilisés : l'agarose et le polyacrylamide. On peut faire varier la concentration de polymère par rapport à celle du tampon, ainsi que son taux de réticulation. Plus le polymère est concentré et réticulé, et plus la taille des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les propriétés du gel à la taille des molécules à analyser.

• L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ;

• Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4% à 20% (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites : protéines, peptides et des fragments d'acides nucléiques. On peut aussi faire varier sa réticulation (taux de ramification) lors de la polymérisation pour moduler les paramètres de séparation ;

Pour les deux types de polymères, le gel peut se faire en conditions natives ou en conditions dénaturantes. Dans ce second cas, on ajoute un agent dénaturant dans le tampon : un détergent, le SDS pour la séparation des protéines (on parle alors de SDS-PAGE), un agent chaotropique, l'urée, pour les acides nucléiques.

On peut aussi faire des électrophorèses en gel d'amidon.