Microscope confocal - Définition

Description du dispositif

Source de lumière

La plupart du temps, la source d'excitation utilisée n'est plus une lampe à arc, mais un (ou plusieurs) faisceau(x) laser. L'intérêt des lasers est de fournir une lumière monochromatique plus spécifique et facile à contrôler (en termes de filtrage). De plus la finesse du pinceau laser permet d'améliorer considérablement la résolution en XY (dans le plan) du fait d'une moindre diffusion.

Les lasers utilisés le plus fréquemment sont les suivants :

• argon-ion (longueurs d'onde : 457 nm, 488 nm, 514 nm)
• hélium-néon (longueurs d'onde : 543 nm, 633 nm)

Si l'on utilise une source de lumière blanche à la place d'un laser, il est également possible d'obtenir des images en couleur avec un microscope confocal. Il est toutefois plus difficile de focaliser la lumière blanche avec une forte intensité sur l'objet, ce qui augmente le temps d'acquisition. Les microscopes confocaux en lumière blanche utilisent en général plusieurs rayons de manière simultanée, ce qui permet d'observer plusieurs endroits de l'échantillon à la fois. Grâce à des dispositifs astucieux comme un disque de Nipkov, il est possible de réaliser des images en temps réel.

Système de balayage

Le balayage du champ observé par le laser se fait à l’aide de deux miroirs orthogonaux. Il s'agit de miroirs galvanométriques très rapides (entre 200 Hz et 2 KHz selon les modèles) effectuant le balayage en X, suivi d'un miroir permettant le balayage en Y.

Le positionnement de l’image dans la profondeur de l’échantillon est généralement obtenue en déplaçant en Z l’objectif à l’aide d’un quartz piezoélectrique par pas successifs de 200-300 nm.

Détecteurs

Les détecteurs utilisés sont des tubes photo-multiplicateurs (PMT) ou une caméra CCD haute sensibilité. L’intensité lumineuse est mesurée et numérisée en fonction de la position du laser dans l’échantillon : on obtient directement des images numériques.

L'utilisation de photo-multiplicateurs (PMT) comme capteurs, à la place de l'œil ou de l'appareil photo, est rendue nécessaire par le très faible signal émis pour chaque position du faisceau. Pour chacune de ces positions, le PMT va produire un signal électrique proportionnel au niveau de lumière collecté. Ce signal électrique est ensuite numérisé pour constituer une matrice de pixels. En travaillant en 8 bits on obtient ainsi une image en 256 niveaux de gris, qui sont ensuite "colorés" artificiellement afin de différencier dans une superposition les fluorescences émises par plusieurs fluorochromes. Les images obtenues ont un champ variant de 64 x 64 à 2 048 x 2 048. Plus la résolution est élevée, plus le temps d'acquisition est long, ce qui peut devenir une limite pour l'acquisition de phénomènes biologiques rapides sur du matériel vivant. Enfin, le fichier généré est plus volumineux (problème de stockage mémoire).

Traitement de l'image

Le résultat d'une observation en microscopie confocale peut être considéré comme une tomographie à l'échelle cellulaire. Une fois la tomographie obtenue, elle peut être traitée de différentes façons :

• en réunissant les différentes images, on reconstitue une vue en deux dimensions de l'ensemble de la préparation parfaitement nette en tout point ;
• en créant une image stéréoscopique donnant une vue en trois dimensions de la préparation ;
• comme tous les éléments d'une même image se trouvent à la même profondeur de la préparation, on peut déterminer les connexions entre les différents éléments observables.

Ces usages ne sont toutefois pas limitatifs et dépendent des besoins et de l'imagination des scientifiques.