La dynastie des Přemyslides s’éteint avec Venceslas III, mort sans héritier. La couronne de Bohême (et les riches mines d’argent de Kutná Hora) passent par alliance à Jean de Luxembourg, le fils de l’empereur Henri VII, qui a épousé Elisabeth Přemysl, fille de Venceslas II et sœur de Venceslas III. C’est surtout leur fils, Charles IV, roi de Bohème et empereur d'Allemagne, qui apporte des changements radicaux au Château dont les embellissements reflètent l’âge d’or que la Bohême vit alors. Outre l’attention portée à l’édification de la cathédrale, Charles IV fait édifier la Chapelle de Tous-les-Saints, dans le prolongement du palais impérial, où repose saint Procope de Sázava.
À l’origine de la cathédrale, il y a le présent fait aux environs de l’an 925, par le roi de Francie orientale, Henri l’Oiseleur au duc Venceslas Ier, une relique de Saint Vit et que celui-ci place dans une église en forme de rotonde qu’il fait édifier à cet effet sur un lieu de culte païen.
Lorsqu’en 973, Prague est élevée au rang d’évêché, c’est cette rotonde, plutôt que l’église Saint-Georges qui est celle des ducs de Bohême, qui est choisie par le nouvel évêque pour y abriter sa chaire, le trône épiscopal. En 1060, une basilique romane à trois nefs s’élève à la place de la rotonde originelle ; construite sur ordre de Spytihněv II, elle est en pierre blanche, sa nef fait 70 mètres de long et l’admiration de ses contemporains.
Le 30 avril 1344, Prague est élevée au rang d’archevêché par le pape Clément VI et sous l’impulsion du roi Jean, la construction d’une cathédrale métropolitaine est entreprise le 21 novembre de la même année. Mathieu d’Arras en est l’architecte (1344-52) puis Peter Parler (1356-99). Comme pour nombre de cathédrales, le chantier s’étale sur plusieurs siècles; celui de la Cathédrale de Prague ne s’achève qu’en 1929. Mathieu d’Arras s’inspire du plan de la cathédrale Saint-Just-et-Saint-Pasteur de Narbonne. Peter Parler apporte une innovation en faisant du triforium un élément autonome qui, au lieu du buter sur les piliers, se brise et les contourne pour créer un mouvement ondulatoire sur toute la longueur de la nef.
À la mort de Parléř, ses fils prennent la tête du chantier mais, en 1420, les guerres hussites mettent un terme à la construction. Elle ne reprend qu’en 1560, après le grand incendie qui a ravagé Malá Strana et le Château, avec l’architecte Bonifác Wohlmut qui coiffe la tour sud d’un bulbe renaissance à tourelles d’angles. En 1770, Nicolò Pacassi reconstruit la tour sud incendiée par la foudre et la surmonte d’un toit baroque en forme de bulbe.
C’est entre 1861 et 1929, avec le voûtement de la nef et construction de la façade ouest et de ses tours néogothiques que la cathédrale est finalement achevée. Le pouvoir impérial s’est désintéressé de Prague et c’est essentiellement grâce à une souscription populaire que le chantier est achevé, à temps pour célébrer le millénaire de saint Venceslas qui la fonda et qui lui donne aussi partiellement son nom.
Les vitraux ont été réalisés d'après les esquisses des peintres et graveurs tchèques les plus célèbres du moment dont Max Švabinský, František Kysela, Alfons Mucha, Cyril Bouda, Karel Svolinský et bien d'autres. L'œuvre de Mucha de style Art Nouveau tardif représente La Légende de Cyrille et Méthode (1931). Outre ce fameux vitrail, on remarque les autres réalisés pour la plupart dans les années 1930, et de style bien différent.
La chapelle funéraire de saint Venceslas est ornée de peintures murales représentant la vie du saint sur la partie haute et d’un parement de pierres semi-précieuses sur la partie basse. Elle contient le tombeau du saint.
La crypte funéraire des rois de Bohême renferme les tombeaux de Charles IV du Saint-Empire et ses trois épouses, de Venceslas Ier du Saint-Empire et de son frère Jean de Görlitz, de Georges de Poděbrady, de Rodolphe II du Saint-Empire et d'autres membres de la famille impériale du Saint-Empire ou royale de Bohême.
Le tombeau en argent de saint Jean Népomucène (1736) sur un projet de Fischer von Erlach.
La Porte d’Or est un portail aux nervures dédoublées qui forment des triangles curvilignes. Elle est surmontée d'une mosaïque, œuvre d'artisans vénitiens en quartz, calcédoine et carreaux de verre de Bohême, représentant Le Jugement dernier et datant du règne de Charles IV. Derrière cette mosaïque se trouve la « chambre du trésor » où sont entreposés les joyaux de la Couronne de Bohême.
La Tour sud présente une base gothique et un toit baroque, sa fenêtre médiane est ornée d’une grille Renaissance d’une extraordinaire finesse. Haute de 96 m, on y admire le panorama sur le Château et la ville.
La croix monumentale en bois dans le bas-côté gauche derrière la nouvelle sacristie a été sculptée par František Bílek en 1899.