En 1678, il parcourt la Savoie et le Dauphiné d'où il rapporte quantité de plantes pour commencer son herbier. En 1679, il part à Montpellier étudier la médecine et l'anatomie mais aussi la flore de cette région. En 1681, il part pour Barcelone dont il explore les environs. Sa vie y est rude, on dit qu'il doit cacher son argent dans son pain noir pour échapper aux voleurs. À la fin de 1681, il rentre à Montpellier et à Aix-en-Provence pour augmenter son herbier de ses dernières récoltes. En 1683, l'herbier qu'il a constitué est si riche et sa renommée telle que par l'entremise de Mme de Venelle, Guy-Crescent Fagon (1638-1718) le fait venir à Paris pour lui confier sa chaire de botanique au Jardin des Plantes (1683) établi par Louis XIII pour l'instruction des jeunes étudiants en médecine. Ses cours sont célèbres et attirent de très nombreux auditeurs, y compris de l'étranger. Il continue néanmoins de voyager en Espagne et au Portugal, en Andalousie où il s'intéressera à la reproduction des palmiers. Il ira aussi en Hollande où il rencontrera Paul Hermann (1646-1695), professeur de botanique à Leyde, qui lui propose sa place de professeur. Il refusera cette offre.
En 1691, Tournefort est reçu à l'Académie des sciences. Il publia en 1694 son premier ouvrage Éléments de botanique ou méthode pour connaître les plantes en trois volumes. Il précise dans son avertissement que « la méthode suivie est fondée sur la structure des fleurs et des fruits. On ne saurait s'en écarter sans se jeter dans d'étranges embarras… ». Cet ouvrage ayant eu énormément de succès, il le traduit lui-même en latin sous le titre Institutiones rei herbariae pour qu'il puisse être lu dans toute l'Europe.
En 1696, Tournefort est reçu docteur de la faculté de médecine de Paris. En 1698, il fait paraître une flore parisienne sous le titre d’Histoire des plantes qui naissent aux environs de Paris, avec leur usage en médecine, petit volume de 543 pages, dédié à Fagon.
Après son retour de son voyage au Levant, Tournefort est nommé, en 1706, professeur au Collège royal, où il est titulaire de la chaire de médecine et botanique.
Jouissant d'une santé robuste, il aurait pu pendant longtemps encore faire progresser la science. Or, revenant du jardin royal en portant un paquet de plantes sous le bras, il fut violemment heurté par une charrette dans la rue Lacépède. Il perdit beaucoup de sang et après un mois de maladie, il mourut le 28 décembre 1708, à l'âge de 52 ans.
Il lègue ses manuscrits à son élève et ami, Michel Louis Renaume de la Garance (1676-1739). Son ami de toujours Pierre Joseph Garidel a dit à son sujet dans son livre Histoire des plantes qui naissent aux environs d'Aix-en-Provence et dans plusieurs autres endroits de la Provence « qu'il a été de nos jours et sera dans les siècles à venir un sujet d'admiration ».