Microscope confocal à balayage laser
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Le microscope confocal à balayage laserMCBL (en anglais CLSM pour confocal laser scanning microscope) est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 600 nm) appelées " sections optiques ". En positionnant le plan focal l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet.

L'objet (De manière générale, le mot objet (du latin objectum, 1361) désigne une entité définie dans un espace à trois dimensions, qui a une fonction précise, et...) n'est pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par ordinateur (Un ordinateur est une machine dotée d'une unité de traitement lui permettant d'exécuter des programmes enregistrés. C'est un ensemble de circuits...).

Le microscope confocal fonctionne en lumière (La lumière est l'ensemble des ondes électromagnétiques visibles par l'œil humain, c'est-à-dire comprises dans des longueurs d'onde de 380nm (violet) à...) réfléchie ou en fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur. (on parle parfois de « lumière froide »). Elle peut servir à caractériser un matériau.).

Le principe du microscope confocal a été décrit par Marvin Minsky (Marvin Lee Minsky (né le 9 août 1927) est un scientifique américain. Il travaille dans le domaine des sciences cognitives et de l'intelligence artificielle. Il est également cofondateur, avec l'informaticien John...) en 1953, mais ce n’est que dans la fin des années 1980 que des modèles commerciaux sont apparus, rendant cette technique accessible à de nombreux laboratoires. La microscopie (La microscopie est l'observation d'un échantillon (placé dans une préparation microscopique plane de faible épaisseur) à travers le microscope. La microscopie permet de rendre visible des éléments...) confocale est très utilisée en biologie (La biologie, appelée couramment la « bio », est la science du vivant. Prise au sens large de science du vivant, elle recouvre une partie des sciences naturelles et de l'histoire naturelle des êtres vivants...) ainsi qu’en sciences des matériaux (Un matériau est une matière d'origine naturelle ou artificielle que l'homme façonne pour en faire des objets.).

Principe et caractéristiques

En microscopie optique (L'optique est la branche de la physique qui traite de la lumière, du rayonnement électromagnétique et de ses relations avec la vision.) classique, pour qu'une image soit nette (Le terme Nette est un nom vernaculaire attribué en français à plusieurs espèces de canards reconnaissablent à leurs calottes. Le terme est un emprunt au grec ancien νη̃ττα,...), il faut que l'objet soit dans le plan focal du système optique. Lorsqu'un objet est épais, présente un relief (Le relief est la différence de hauteur entre deux points. Néanmoins, ce mot est souvent employé pour caractériser la forme de la surface de la Terre.) important, ou bien lorsqu'il est incliné par rapport à l'objectif, seule une partie de l'objet est nette dans l’image (voir l'article sur la profondeur de champ).

Pour résoudre ce problème, on éclaire la surface (Une surface désigne généralement la couche superficielle d'un objet. Le terme a plusieurs acceptions, parfois objet géométrique,...) non plus par un faisceau de lumière blanche, mais par un rayon laser (Un laser est un appareil émettant de la lumière (rayonnement électromagnétique) amplifiée par émission stimulée. Le...), concentré par une lentille, qui balaie la surface en positionnant une sténopée (pinhole en anglais) devant le détecteur (Un détecteur est un dispositif technique (instrument, substance, matière) qui change d'état en présence de l'élément ou de la situation pour lequel il a été spécifiquement conçu.), dans un plan focal conjugué (En mathématiques, le conjugué d'un nombre complexe z est le nombre complexe formé de la même partie réelle que z mais de partie imaginaire opposée.) au plan focal de l’objectif (plans confocaux). De cette manière, seuls les photons provenant du plan focal passent la sténopée et participent à la formation de l’image, d'où le nom " confocal " (synonyme de monofocal).

Le balayage par le laser se fait à l’aide de deux miroirs orthogonaux. Les détecteurs utilisés sont des tubes photo-multiplicateurs (PMT), l’intensité lumineuse est mesurée et numérisée en fonction de la position du laser dans l’échantillon : on obtient directement des images numériques.

L’emploi d’une source lumineuse cohérente (laser) ainsi que la taille réduite du champ (Un champ correspond à une notion d'espace défini:) éclairé permettent d’obtenir une résolution latérale légèrement meilleure (180-160 nm) à celle attendue pour un microscope optique conventionnel (200 nm). La résolution en Z (profondeur) est de l’ordre de 600 nm en microscopie confocale.

Les lasers utilisés le plus fréquemment sont les suivants :

  • argon-ion (longueurs d'onde : 457nm, 488nm, 514nm)
  • hélium-néon (543nm)
  • hélium-néon (633nm)

Le positionnement (On peut définir le positionnement comme un choix stratégique qui cherche à donner à une offre (produit, marque ou enseigne) une position crédible, différente et attractive au sein d’un marché et dans l’esprit des clients...) de l’image dans la profondeur de l’échantillon est généralement obtenue en déplaçant en Z l’objectif à l’aide d’un quartz piezo-électrique par pas successifs de 200-300nm.

Autres techniques apparentées

Microscopie de fluorescence par excitation multiphotonique

Technique très similaire à la microscopie confocale à balayage laser elle emploie le même matériel. La faible profondeur de champ est obtenue en n’excitant la fluorescence que dans un volume (Le volume, en sciences physiques ou mathématiques, est une grandeur qui mesure l'extension d'un objet ou d'une partie de l'espace.) restreint par excitation multiphotonique à l’aide de lasers pulsés. Cette excitation consiste en l'absorption ( En optique, l'absorption se réfère au processus par lequel l'énergie d'un photon est prise par une autre entité, par exemple, un atome qui fait une transition...) quasi-simultanée de plusieurs photons d'excitation d'une longueur (La longueur d’un objet est la distance entre ses deux extrémités les plus éloignées. Lorsque l’objet est filiforme ou en forme de lacet, sa longueur est celle de...) d'onde (Une onde est la propagation d'une perturbation produisant sur son passage une variation réversible des propriétés physiques locales. Elle transporte de l'énergie sans transporter de matière. Une onde transporte aussi de la...) proche d'un multiple de l'excitation optimale à un photon (En physique des particules, le photon est la particule élémentaire médiatrice de l'interaction électromagnétique. Autrement dit, lorsque deux...). La totalité de la fluorescence arrive au niveau du détecteur, il n’y a plus de sténopée. On ne peut donc plus parler de microscopie confocale, bien qu’on emploie quelquefois le terme de microscopie confocale multiphotonique de manière abusive. Bien souvent les applications sont limitées à la microscopie biphtonique (excitation du fluorophore par deux photons). Outre l'aspect d'excitation naturellement confocale, cette technique est utilisée pour l'excitation simultanée de plusieurs fluorophores à spectres d'émission différents.

Microscope à fluorescence (La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'emettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus forte énergie (plus courte longueur d'onde).) par excitation multiphotonique multifocale (triMscope)

Le principe est identique, mais le faisceau laser est divisé en plusieurs faisceaux ce qui permet de balayer simultanément plusieurs points. Ceci permet de diminuer le temps (Le temps est un concept développé par l'être humain pour appréhender le changement dans le monde.) d’acquisition des images.

Microscope de fluorescence par réflexion totale interne (En optique géométrique, un rayon lumineux traversant une séparation entre deux milieux d'indices optiques différents peut subir une réflexion et une réfraction. Lorsqu'il n'y a...)

permet d’obtenir une meilleure profondeur de champ (200 nm) que la microscopie confocale (600 nm), mais uniquement à la base de l’échantillon (plus précisément au niveau de l’interface échantillon/support transparent.

Autres techniques

  • Microscope Confocal à Disque (Le mot disque est employé, aussi bien en géométrie que dans la vie courante, pour désigner une forme ronde et régulière, à l'image d'un palet — discus en latin.) Rotatif (ou disque de Nipkow - spinning disk).
  • Microscope confocal spectral.
  • Spectroscopie par corrélation de fluorescence
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