Le mécanisme d'action de cet herbicide n'est pas entièrement compris à l'heure actuelle. On sait cependant que son action phytotoxique est due à l'inhibition de l'enzyme 5-enolpyruvoyl-shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) impliquée dans la voie métabolique de l'acide shikimique, laquelle est nécessaire pour la synthèse des acides aminés aromatiques tels que la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane ; ces acides aminés participent à la synthèse des vitamines et de beaucoup de métabolites secondaires comme les molécules hormonales d'intérêt sur le développement de la plante telles que les folates, l'ubiquinone et des naphthoquinones. Cette voie étant absente chez les animaux, il fut supposé de faible toxicité chez eux. Cependant, de nombreuses études tendent à démontrer le contraire.
Enfin, les analyses permettant de détecter le glyphosate dans l'eau ont longtemps été difficiles, longues et coûteuses. Elles étaient donc rares. Depuis que dans les années 2000, des progrès techniques ont amélioré leur précision et en ont diminué les coûts, on prend conscience que bien que dégradable, le glyphosate est très souvent présent dans les eaux et les sols. Une étude de l'IFEN (août 2006) a montré que le glyphosate et l'AMPA, son produit de dégradation, étaient les substances les plus retrouvées dans les eaux en France. En effet, le glyphosate est maintenant l'herbicide le plus vendu en France.
On a commencé dans les années 2000 à étudier la volatilité et la cinétique du glyphosate dans l'air (où l'on retrouve d'autres pesticides qui peuvent aussi contaminer les pluies), mais les mesures (en 2006/2007) sont encore très imprécises car les résines adsorbantes chargées de piéger le glyphosate dans l'air des analyseurs le fixent mal, une partie du glyphosate étant désorbé du filtre au fur et à mesure que l'air y passe.
De plus, étant donné l’importance probable des synergies entre produits, entre produits et molécules de dégradation, et entre toutes ces molécules et celles de l'environnement ou de notre organisme, toute évaluation certaine du risque reste difficile étant donné la rareté des données et éléments toxicologiques disponibles. Les premières analyses doivent être considérées comme de premiers indices et éventuellement des éléments d'aide à la précaution/prévention.
Le glyphosate est notamment utilisé par le gouvernement colombien, aidé par le gouvernement des États-Unis dans son Plan Colombie pour détruire les champs de coca produisant de la drogue qui finance des actions de groupes rebelles. Ces actions détruisent des milliers d'hectares de reliques de forêt tropicale, parfois classées réserves naturelles, comme la forêt du Putumayo, et des exploitations agricoles légales. Les populations de ces forêts craignent des impacts sur leur santé, comme dans le cas du Roundup pulvérisé en Palestine, ou, antérieurement, avec l'agent orange utilisé comme défoliant pendant la guerre du Viêt Nam. Les communautés amérindiennes sont parmi les premières touchées. L'Équateur voisin craint aussi des conséquences sanitaires et écologiques des fumigations colombiennes de glyphosate près de ses frontières, dans le Putumayo. Le refus colombien d'abandonner ces pulvérisations aériennes a provoqué en 2006-2007 une crise diplomatique entre les deux pays.
La culture majoritaire de soja OGM résistant au glyphosate en Argentine a entraîné une utilisation massive de ce désherbant. Des résistances sont apparues, amenant à l'utilisation de doses de plus en plus importantes. La dévégétalisation des sols, associée au labour, est cause de perte d'humus, d'une dévitalisation et d'une défertilisation des sols.
La polémique a aussi porté sur la biodégradabilité de désherbants contenant du glyphosate. Un fabricant (Monsanto) a perdu un procès parce qu'il avait présenté le Roundup, sur ses étiquettes et affiches, comme dégradable ou biodégradable (dans le sol comme dans l'eau). La demi-vie du glyphosate (le temps nécessaire pour que 50 % des molécules de glyphosate soient dégradées) est, en conditions de laboratoire, d'environ 32 jours dans le sol et de 3,3 jours dans l'eau, avec une efficacité variant selon la richesse du sol en bactéries, la température, la nature et l'acidité du sol, etc. Elle varierait de 20 à 100 jours selon l’état du sol d'après d'autres sources. Le glyphosate se dégrade en sous-produits, eux-mêmes difficilement biodégradables, avec des délais variant selon le contexte.
Le problème est que ces chiffres semblent porter sur la matière active et non sur le surfactant, ni sur les impacts synergiques possibles des sous-produits de dégradation, notamment lorsqu'ils sont combinés avec les produits de dégradation du surfactant qui pourrait être une des causes de toxicité du produit.