Enzyme-linked immunosorbent assay - Définition

Introduction

Une plaque de microtitrage à 96 puits, couramment utilisée pour les tests ELISA.

ELISA est l'acronyme d'un examen de laboratoire appelé (en anglais) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, littéralement « dosage d'immunoadsorption par enzyme liée », c'est-à-dire dosage immunoenzymatique sur support solide.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (Radio ImmunoAssays) dans lesquels l'anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

L'ELISA est une technique biochimique, principalement utilisée en immunologie, mais pas uniquement, afin de détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.
La technique utilise un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène.
L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV ou le virus du Nil), que pour détecter la présence d'un antigène. Il a également trouvé des applications dans l'industrie de l'alimentation, afin de détecter des allergènes alimentaires, comme le lait, les cacahuètes, les noix et les œufs. C'est un test simple, facile d'emploi et peu coûteux. Il est limité par la disponibilité en anticorps spécifique.

Méthodes

ELISA indirect

Les étapes de l'ELISA dit indirect, le plus couramment utilisé, pour déterminer la concentration en anticorps du sérum sont :

1. l'application d'un échantillon d'un antigène connu sur une surface, le plus souvent celle d'un puits d'une plaque de microtitration. L'antigène est fixé à la surface, de façon à le rendre immobile.
2. le recouvrement des puits (ou toute autre surface) par les échantillons de sérum à tester (ou tout autre solution à tester), dont la concentration en anticorps est, par définition, inconnue, et habituellement diluée dans le sérum d'une autre espèce. L'utilisation de sérum non-humain empêche la liaison à l'antigène par des anticorps non-spécifiques contenus dans le sang du patient.
3. le rinçage de la plaque, de façon à retirer les anticorps non-liés. Après rinçage, seuls les complexes antigène-anticorps demeurent attachés à la surface du puits.
4. l'ajout aux puits des anticorps secondaires, qui se lieront à tout anticorps primaire. Ces anticorps secondaires sont couplés à l'enzyme modificatrice de substrat qui permet de suivre l'évolution de la réaction.
5. le second rinçage de la plaque, de sorte à éliminer les anticorps non liés.
6. l'application d'un substrat qui, s'il est converti par l'enzyme, émet un signal chromogénique ou fluorescent.
7. la quantification du résultat, à la vue ou, le plus souvent, par spectrophotométrie ou tout autre appareil d'optique.

L'enzyme agit comme amplificateur : quand bien même peu d'anticorps conjugués à l'enzyme seraient attachés, l'enzyme catalyserait la formation de nombreux signaux, ce qui rend ce test très sensible, mais augmente également le nombre de faux positifs. Il faut donc, comme d'habitude, prévoir des puits "contrôle".

L'ELISA peut être réalisé à visée quantitative ou qualitative :

• un résultat qualitatif indiquera la présence ou l'absence d'un antigène dans l'échantillon. Les valeurs-seuil sont déterminées par l'analyste et peuvent être basées sur la statistique. Deux ou trois écarts-types sont généralement utilisés pour distinguer l'échantillon positif du négatif.
• dans l'utilisation quantitative de l'ELISA, la densité optique ou les unités de fluorescence de l'échantillon sont interpolées sur une courbe d'étalonnage, en général une dilution sérielle de la cible.

Applications

Essais quantitatifs (dosages)

On utilise l'ELISA indirect pour le dosage de protéines variées. Quelques exemples tirés d'application en pharmacologie médicale : hormones thyroïdiennes, taux de médicaments (pour évaluer l'observance et/ou adapter la posologie), etc. Dans le domaine de la recherche, les tests ne sont limités que par l'imagination du chercheur.

Essais qualitatifs : le test VIH par ELISA

L'application la plus connue du grand public est le dépistage en première ligne du VIH.

La technique ELISA permet la détection d'anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d'où le terme de séropositivité ou de séronégativité). La technique présente comme indiqué une grande sensibilité (c'est-à-dire que la plupart des cas sont détectés, et que les "faux négatifs" - les tests négatifs alors que le patient est en réalité séropositif - sont quasi à exclure, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (c'est-à-dire un taux assez faible de "faux positifs" - le test est positif parce que l'anticorps a réagi à un antigène non spécifique). Toutefois, en cas de sérologie anti-VIH positive, les échantillons doivent être soumis à des tests de confirmation, comme le western blot, qui utilise une technique basée sur l'électrophorèse et dont le taux d'erreur est extrêmement faible.

ELISA en sandwich

Un ELISA en sandwich. (1) La plaque est recouverte avec un anticorps de capture; (2) l'échantillon est ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture; (3) l'anticorps de détection est ajouté, et se lie à l'antigène; (4) L'anticorps secondaire lié à l'enzyme est ajouté, et se lie à l'anticorps de détection; (5) Le substrat est ajouté et est converti par l'enzyme en une forme détectable (colorée ou fluorescente).

L'ELISA en sandwich est une variante moins commune (en clinique) de cette technique, utilisée afin de détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou tout autre échantillon. Cette technique est par contre d'un usage très courant en recherche.

Le procédé se déroule, dans ses grandes lignes, comme suit :

1. Une surface est préparée et une quantité connue d'anticorps dit de capture y est liée.
2. L'échantillon contenant l'antigène est appliqué à la plaque.
3. La plaque est rincée, de façon à éliminer l'antigène non-lié.
4. Les anticorps conjugués à l'enzyme sont ajoutés.
5. La plaque est rincée une seconde fois.
6. Le substrat convertible par l'enzyme en signal fluorescent est ajouté.
7. Le résultat est analysé "à l'œil" ou dans un spectrophotomètre spécialement conçu pour accepter directement les plaques de 96 puits.

Toutefois, ainsi qu'illustré, il existe le plus souvent une étape supplémentaire, l'addition d'anticorps de détection, afin d'éviter de créer des anticorps conjugués à l'enzyme pour chaque antigène. L'utilisation d'une enzyme couplée reconnaissant la fraction Fc des autres anticorps permet de l'utiliser dans une variété de situations et de réduire le coût de la procédure.

ELISA par compétition

Une troisième utilisation de l'ELISA se fait par compétition de liaison. Les étapes de cet ELISA diffèrent quelque peu des manœuvres précédentes:

1. Un anticorps non-marqué est incubé en présence de son antigène.
2. Les complexes immuns qui en résultent sont ensuite versés dans un puits recouvert d'antigène.
3. La plaque est rincée, de sorte que l'anticorps non-lié est éliminé (Plus grande est la teneur en antigène de l'échantillon, plus faible est la quantité d'anticorps qui sera capable de se lier aux antigènes du puits, d'où la "compétition.")
4. L'anticorps secondaire, spécifique de l'anticorps primaire, est ajouté. L'anticorps secondaire est conjugué à l'enzyme.
5. Un substrat est ajouté, et les enzymes restantes provoquent l'émission d'un signal chromogénique ou fluorescent.

Donc, dans l'ELISA de compétition, plus haute est la concentration initiale de l'antigène, plus faible est le signal.