Western blot - Définition et Explications

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Introduction

Un transfert de protéines (également appelé western blot ou buvardage de western), est une méthode de biologie moléculaire permettant la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique (sérum ou autre extrait ou homogénat tissulaire). C'est un outil (Un outil est un objet finalisé utilisé par un être vivant dans le but d'augmenter son...) de diagnostic (Le diagnostic (du grec δι?γνωση, diágnosi, à partir de...) complémentaire.

Technique

Cette technique née des progrès de la protéomique, de la biologie moléculaire (La biologie moléculaire (parfois abrégée bio mol ou BM) est une discipline...) et de l'Immunofluorescence utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour séparer des protéines, préalablement dénaturées, selon leur masse (Le terme masse est utilisé pour désigner deux grandeurs attachées à un...).
Ces protéines sont ensuite transférées depuis le gel sur une membrane (typiquement en nitrocellulose), où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine (Une protéine est une macromolécule biologique composée par une ou plusieurs...) d'intérêt. Il est possible grâce à cette technique de détecter la présence d'une protéine dans un tissu, d'évaluer sa taille, sa concentration, les variations de cette concentration, effectuer des comparaisons de concentrations entre différents groupes, etc. D'autres techniques utilisant les anticorps permettent la détection de la protéine dans les cellules après fixation (immunocytochimie) et dans les tissus (immunohistochimie).

La méthode fut mise au point (Graphie) dans le laboratoire de George Stark à Stanford. Le nom du western blot, donné à la technique par Burnette WN., est un jeu de mot à partir de la technique du Southern (Southern est le nouveau nom de la concession ferroviaire, initialement exploitée par Connex South...) blot ou transfert de Southern, technique de détection d'ADN nommée d'après son inventeur, Edwin Southern et non d'après le point cardinal (En géographie, un point cardinal est l'une des quatre principales directions d'une boussole sur un...). La détection d'ARN est appelée northern blot ou transfert de northern . Toutes ces techniques dérivent leur nom de l'étape de transfert sur membrane, comparée à une empreinte sur buvard (blot = tache en anglais)

Applications médicales en diagnostic

  • Les tests VIH de confirmation emploient la méthode du transfert de western afin de détecter un anticorps anti-HIV dans un échantillon (De manière générale, un échantillon est une petite quantité d'une matière, d'information, ou...) de sérum. Des protéines de cellules que l'on sait infectées par le VIH sont séparées et transférées sur membrane comme décrit ci-dessus. Le sérum à tester est appliqué. L'étape d'incubation (L'incubation est la période pendant laquelle les ovules sont couvés, de manière à les maintenir...) dans l'anticorps primaire ; les anticorps libres sont éliminés par rinçage de la membrane, et un anticorps dirigé contre les protéines humaines secondaires associé à une enzyme (Une enzyme est une molécule (protéine ou ARN dans le cas des ribozymes) permettant...) ou un chromophore est ajouté. Les bandes marquées indiquent ensuite les protéines contre lesquelles le sérum du patient (Dans le domaine de la médecine, le terme patient désigne couramment une personne recevant...) contient des anticorps.
  • Le transfert de western est également utilisé pour le test de confirmation de l'ESB (dite 'maladie (La maladie est une altération des fonctions ou de la santé d'un organisme vivant, animal...) de la vache (La vache est la femelle d'un mammifère domestique ruminant, généralement porteur de...) folle').
  • Certaines formes de détection de la maladie de Lyme (La maladie de Lyme est une maladie bactérienne. Elle est multiviscérale (pouvant affecter...) utilisent le transfert de western.

Les différentes étapes du transfert de western

Une cuve d'électrophorèse. Les puits de dépôt des échantillons sont colorés en vert (Le vert est une couleur complémentaire correspondant à la lumière qui a une longueur d'onde...), en haut du gel. Un courant électrique (Un courant électrique est un déplacement d'ensemble de porteurs de charge...) est appliqué pour faire migrer les protéines vers le bas.

Préparation des échantillons

Les échantillons (d'un tissu ou d'une culture (La définition que donne l'UNESCO de la culture est la suivante [1] :) cellulaire) sont rapidement refroidis, voire réfrigérés (en dessous de 0°C). Ils sont homogénéisés par sonication (utilisation d'ultra-sons pour rompre les membranes), contrainte mécanique (Dans le langage courant, la mécanique est le domaine des machines, moteurs, véhicules, organes...) ou simplement lysés par utilisation de tampons à haute concentration en sels. Il en résulte un homogénat de tous les compartiments cellulaires, pouvant être utilisé tel quel ou être soumis à plusieurs étapes de centrifugation différentielle afin d'isoler les fractions cytosolique, nucléaire (Le terme d'énergie nucléaire recouvre deux sens selon le contexte :) et membranaire. L'échantillon est ensuite traité de façon à recueillir un taux constant de protéines à partir de chaque échantillon différent. Cela implique un dosage (En chimie analytique, le dosage est l'action qui consiste à déterminer la quantité...) des protéines par la méthode du Biuret ou du bleu (Bleu (de l'ancien haut-allemand « blao » = brillant) est une des trois couleurs...) de Coomassie (Méthode de Bradford).

Les échantillons sont ensuite bouillis de 1 à 5 minutes ( Forme première d'un document : Droit : une minute est l'original d'un...) dans une solution tampon (par exemple le tampon de Laemmli), contenant une substance tampon, généralement du Tris, un colorant (Un colorant est une substance utilisée pour apporter une couleur à un objet à...), un composant sulfhydryl (typiquement du beta-mercaptoéthanol ou du dithiothréitol ou plus simplement DTT), un détergent (Un détergent (ou agent de surface, détersif, surfactant) est un composé chimique,...) anionique lipophile (sodium dodécyl sulfate ou SDS) et du glycérol (Le glycérol ou la glycérine (C3H8O3) est un polyol. Son nom officiel est le...) pour augmenter la poussée (En aérodynamique, la poussée est la force exercée par le déplacement de l'air...) d'Archimède (Archimède de Syracuse (en grec ancien :...).
L'ébullition (L’ébullition est la formation de bulles lors d’un changement violent d’un corps...) dénature les protéines en brisant les faibles liaisons intramoléculaires, ce qui a pour conséquence de les dérouler complètement (Le complètement ou complètement automatique, ou encore par anglicisme complétion ou...). Le SDS leur procure alors un environnement (L'environnement est tout ce qui nous entoure. C'est l'ensemble des éléments naturels et...) riche en charges négatives afin de les solvater et prévenir la précipitation (En météorologie, le terme précipitation désigne des cristaux de glace ou des...), et le composant sulfhydryl empêche la regénération des ponts disulfure. Le glycérol augmente la densité (La densité ou densité relative d'un corps est le rapport de sa masse volumique à la...) de l'échantillon par rapport au tampon dans la partie supérieure du réservoir du gel, facilitant la mise en place des échantillons qui descendront plus facilement au fond des compartiments du gel.

Électrophorèse sur gel

Les protéines de l'échantillon sont séparées selon leur taille par électrophorèse sur gel, dont la composition varie en fonction du laboratoire, du poids (Le poids est la force de pesanteur, d'origine gravitationnelle et inertielle, exercée par la...) moléculaire des protéines d'intérêt et des tampons disponibles. Les gels de polyacrylamide sont les plus fréquents. Les protéines ne traversant le gel que dans une dimension (Dans le sens commun, la notion de dimension renvoie à la taille ; les dimensions d'une pièce...) (du haut vers le bas), les échantillons sont chargés l'un à côté de l'autre dans des "puits" formés dans le gel. Les protéines sont séparées par masse en "bandes" dans chaque "couloir" formé sous les puits. Un couloir est réservé à un "marqueur" ou "échelle standard", une mixture de protéines possédant des poids moléculaires définis disponibles dans le commerce.

Il est également possible d'employer un gel 2D qui, à partir d'un seul échantillon, permet de faire migrer les protéines dans deux dimensions. Les protéines sont alors séparées par leur point isoélectrique (c'est-à-dire le pH auquel leur charge (La charge utile (payload en anglais ; la charge payante) représente ce qui est effectivement...) nette (Le terme Nette est un nom vernaculaire attribué en français à plusieurs espèces...) est neutre) dans la première dimension (Dans le sens commun, la notion de dimension renvoie à la taille ; les dimensions d'une...), et selon leur poids dans la seconde ( Seconde est le féminin de l'adjectif second, qui vient immédiatement après le premier ou qui...).

La composition d'un tampon d'électrophorèse (Running buffer) pour western blot est d'1 volume (Le volume, en sciences physiques ou mathématiques, est une grandeur qui mesure l'extension...) de tampon TGS (Tris-glycine-SDS) concentré 10 fois dans 9 volumes d'eau (L’eau est un composé chimique ubiquitaire sur la Terre, essentiel pour tous les...) distillée.

Transfert sur membrane

Afin de rendre les protéines accessibles à la détection par anticorps, elles sont transférées depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose (La nitrocellulose ou nitrate de cellulose est un produit chimique, explosif, dérivé de la...) ou de PVDF. La membrane est placée face-à-face avec le gel, et un courant électrique est appliqué aux grandes plaques sur l'un des deux côtés. Les protéines chargées migrent depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation (Une organisation est) relative qu'elles avaient dans le gel. Il résulte de ce transfert que les protéines sont exposées sur une surface (Une surface désigne généralement la couche superficielle d'un objet. Le terme a...) mince, ce qui facilite les étapes de détection ultérieures. Tant les membranes de nitrocellulose que de PVDF sont "collantes", liant (Un liant est un produit liquide qui agglomère des particules solides sous forme de poudre....) des protéines de manière non-spécifique (c'est-à-dire qu'elles lient toutes les protéines présentes dans l'échantillon de la même façon). La fixation des protéines à la membrane se fait grâce à des interactions hydrophobes et ioniques entre la membrane et les protéines. Bien que les membranes de nitrocellulose soient moins chères que celles en PVDF, elles sont moins solides et ne peuvent être employées plusieurs fois. À la différence de celles en nitrocellulose, les membranes de PVDF doivent être imbibées de méthanol (Le méthanol, également connu sous le nom d’alcool méthylique, de carbinol,...) ou d'isopropanol (L'isopropanol, ou alcool isopropylique est le nom commun pour le propan-2-ol, composé chimique...) à 100% avant leur utilisation.

La composition pour un litre (Le litre (du grec λίτρα lítra, ancienne mesure de capacité...) d'un tampon de transfert type est de :

  • 700 ml d'eau distillée
  • 100 ml de tampon TG (Tris-glycine) concentré 10 fois
  • 200 ml de méthanol
  • 4 ml de SDS

Blocage

La membrane ayant été choisie pour ses propriétés de liaison non-spécifique, comme tant la protéine-cible que les anticorps sont des protéines, des précautions doivent être prises pour minimiser les interactions entre membrane et anticorps. Le blocage des sites d'interactions non spécifiques entre la membrane et les anticorps est réalisé en plongeant la membrane dans une solution diluée de protéines - le plus souvent de l'albumine de sérum bovin ou ASB (BSA en anglais) ou du lait sans matières grasses (lait dilué à 5% - 5 g pour 100 ml) - en présence de détergent, typiquement du Tween® 20), pendant une heure (L’heure est une unité de mesure du temps. Le mot désigne aussi la grandeur...) à température (La température est une grandeur physique mesurée à l'aide d'un thermomètre et...) ambiante.
Les protéines dans la solution diluée se lient à la membrane dans tous les sites non-occupés par la protéine-cible. De la sorte, lorsque les anticorps sont appliqués lors de l'étape suivante, ils ne peuvent (idéalement) plus s'attacher à la membrane que sur les sites de liaison de la protéine-cible, ce qui réduit le "bruit de fond (Dans son sens courant, le mot de bruit se rapproche de la signification principale du mot son....)" dans le produit final du transfert de western, donne des résultats plus clairs et élimine les faux positifs.

Détection

Au cours de la détection, la membrane est "sondée" pour la protéine d'intérêt avec des anticorps, liés ensuite à une enzyme émettant un signal ( Termes généraux Un signal est un message simplifié et généralement codé. Il existe...) photométrique ou colorimétrique, ou bien des photons (En physique des particules, le photon est la particule élémentaire médiatrice de l'interaction...). Pour plusieurs raisons, ceci se produit classiquement en deux étapes, bien que des méthodes en une étape soient disponibles pour certaines applications.

Méthode en deux étapes

Anticorps primaire

Les anticorps sont générés par inoculation à l'animal (Un animal (du latin animus, esprit, ou principe vital) est, selon la classification classique, un...) (généralement un lapin (Le mot lapin (/lapε̃/) est un terme très général qui désigne plus...) ou une chèvre) ou exposition d'une culture de cellules immunitaires à la protéine d'intérêt dans son intégralité ou seulement sur l'une de ses fractions (épitope). Toutefois, les protéines ayant été dénaturées lors de l'électrophorèse sur gel, il faut utiliser des anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine dénaturée, et non la protéine native.
La réponse immunitaire normale est dans ce cas exploitée afin de générer des anticorps qui sont récoltés et utilisés comme outils de détection possédant à la fois une bonne sensibilité et une bonne spécificité, se liant directement à la protéine - d'où leur appellation d'anticorps "primaire". Quelques anticorps monoclonaux, beaucoup plus difficiles à réaliser et dont l'affinité est beaucoup plus élevée peuvent également être utilisés en transfert de western.

Après le blocage, une solution diluée d'anticorps primaire (généralement comprise entre 0.5 et 5 micro grammes/ml) est incubée avec la membrane sous agitation (L’agitation est l'opération qui consiste à mélanger une phase ou plusieurs...) modérée. La solution se compose typiquement d'un tampon salin proche du pH neutre (généralement, une faible quantité (La quantité est un terme générique de la métrologie (compte, montant) ; un scalaire,...) de chlorure de sodium), d'un petit pourcentage (Un pourcentage est une façon d'exprimer une proportion ou une fraction dans un ensemble. Une...) de détergent, et parfois de protéines (ASB ou lait 5%) diluées. La solution d'anticorps et la membrane peuvent être scellées dans un sachet en plastique et incubées ensemble (En théorie des ensembles, un ensemble désigne intuitivement une collection...) pour une durée allant de 30 minutes à une nuit. Elle peut aussi être incubée à différentes températures, les températures plus élevées étant associées à plus de liaisons plus spécifiques.

Anticorps secondaire

Après rinçage de la membrane afin d'enlever les anticorps primaires non liés, celle-ci est exposée à un autre anticorps, dirigé contre une portion espèce-spécifique de l'anticorps primaire. Cet anticorps est connu comme anticorps "secondaire", et tend à être référé, du fait de ses propriétés de ciblage, comme "anti-souris, " "anti-chèvre, " "anti-lapin", etc. Les anticorps sont de source animale (mais généralement, d'espèces différentes), ou de cultures d'hybridomes d'origine animale ; un anticorps anti-souris se liera à pratiquement tout (Le tout compris comme ensemble de ce qui existe est souvent interprété comme le monde ou...) anticorps primaire d'origine murine, ce qui permet de réaliser des économies en laissant le laboratoire partager une seule source d'anticorps secondaire, et permet des résultats plus reproductibles. L'anticorps secondaire est généralement lié à la biotine ou à une enzyme qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane, comme une phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort (Le raifort est une plante vivace de la famille des Brassicacées, cultivée pour sa racine...). Cette étape confère un avantage, en ce que plusieurs anticorps secondaires se lieront à un anticorps primaire, permettant d'améliorer le signal.

Le plus communément, un anticorps secondaire lié à la peroxydase de raifort (horseradish peroxidase) est utilisé en conjonction avec un agent luminescent, et le produit de la réaction émet une luminescence (La luminescence est une émission de lumière dite "froide", par opposition à l'incandescence qui...) proportionnelle à la concentration en protéine. Un film photographique sensible est placé contre la membrane et, sous l'exposition de la lumière (La lumière est l'ensemble des ondes électromagnétiques visibles par l'œil...) due à la réaction, crée une image des anticorps liés à la membrane. Plus souvent maintenant, une caméra (Le terme caméra est issu du latin : chambre, pour chambre photographique. Il désigne un appareil...) à CCD est utilisée en place des films photographiques.
Comme pour les procédures d'ELISPOT et ELISA, l'enzyme peut être fournie avec une molécule-substrat qui sera converti par l'enzyme pour émettre un produit de réaction coloré, visible sur la membrane.

Une troisième possibilité consiste à utiliser un marqueur radioactif plutôt qu'une enzyme couplée à l'anticorps secondaire, par exemple en marquant une protéine liant les anticorps, telle que la protéine A (la Protéine A est une protéine de surface de 40-60 KDa initialement trouvée dans les...) du staphylocoque avec un isotope (Le noyau d'un atome est constitué en première approche de protons et de neutrons. En physique...) radioactif de l'iode (L'iode est un élément chimique de la famille des halogènes, de symbole I et de...). Cependant, les autres méthodes étant plus sûres, plus rapides et moins chères, cette méthode est plus ou moins tombée en désuétude, mais demeure parfois utilisée dans certaines circonstances.

Un western blot utilisant un système de détection (Un système de détection est un système permettant à l'utilisateur d'observer un événement...) radioactive

Méthode en une étape

Lorsque la technique est apparue, le processus de détection était réalisé en deux étapes, du fait de la relative facilité de production des anticorps primaires et secondaires en deux procédés distincts. Cela permet aux chercheurs et fournisseurs une certaine souplesse à l'emploi, et ajoute une étape d'amplification (On parle d'amplificateur de force pour tout une palette de systèmes qui amplifient les...) du signal au processus de détection. Toutefois, depuis l'arrivée d'analyses de protéines à haut rendement et à marge de détection plus basse, c'est-à-dire détectant des protéines à très faible concentration, il est devenu intéressant de développer des systèmes de sondage ( Un sondage peut désigner une technique d'exploration locale d'un milieu particulier. Un...) en une étape unique qui permettront un gain de temps (Le temps est un concept développé par l'être humain pour appréhender le...) et une économie de matière (La matière est la substance qui compose tout corps ayant une réalité tangible. Ses...) première. Ces systèmes nécessitent un anticorps de détection pouvant à la fois détecter la protéine d'intérêt et émettre un signal détectable, lesquelles sont souvent disponibles pour des marqueurs de protéine connus. La sonde (Une sonde spatiale est un vaisseau non habité envoyé par l'Homme pour explorer de plus près des...) primaire est incubée avec la membrane à la manière de l'anticorps primaire dans le procédé en deux temps, et est ensuite prête pour la détection directe après une série d'étapes de rinçage.

Analyse

Après rinçage des anticorps secondaires non-liés, le western blot est prêt pour la détection des sondes marquées et liées à la protéine d'intérêt. En pratique, tous les transferts de western ne révèlent pas la protéine sur une bande donnée (Dans les technologies de l'information (TI), une donnée est une description élémentaire, souvent...) de la membrane, les gels n'étant pas complètement exempts de protéines après avoir été épongés. Une approximation (Une approximation est une représentation grossière c'est-à-dire manquant de...) sur la taille est réalisée en comparant les bandes marquées à celles des marqueurs de la gamme étalon chargé durant l'électrophorèse dans un puits à part. Le processus est répété pour une protéine de structure, comme l'actine ou la tubuline, dont la concentration ne devrait pas varier entre les échantillons (contrôle interne). La concentration de la protéine-cible est indexée à celle de la protéine servant de contrôle (Le mot contrôle peut avoir plusieurs sens. Il peut être employé comme synonyme d'examen, de...) interne (En France, ce nom désigne un médecin, un pharmacien ou un chirurgien-dentiste, à la...), afin de normaliser les expériences. Cette pratique permet la correction par rapport au taux de protéines total ( Total est la qualité de ce qui est complet, sans exception. D'un point de vue comptable, un...) sur la membrane, en cas d'erreur ou de transfert incomplet.

Détection colorimétrique

Cette méthode est tributaire, lors de l'incubation du transfert de western, de la présence d'un substrat qui réagit au déclencheur (En programmation procédurale, un déclencheur (trigger en anglais) est un dispositif...) présent sur l'anticorps secondaire (comme la peroxydase). Cela convertit un colorant soluble en une forme insoluble, de couleur (La couleur est la perception subjective qu'a l'œil d'une ou plusieurs fréquences d'ondes...) différente (En mathématiques, la différente est définie en théorie algébrique des...), qui précipite à côté de l'enzyme, teintant donc la membrane de nitrocellulose. Le développement du transfert de western est alors arrêté par rinçage du colorant soluble. La concentration de protéine est évaluée par densitométrie, évaluation de l'intensité de la bande ou par spectrophotométrie (La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer...).

Détection par chimiluminescence

Cette méthode nécessite, lors de l'incubation du transfert de western, la présence d'un substrat qui émet de la lumière après exposition au déclencheur présent sur l'anticorps secondaire. La lumière émise sert à impressionner un film photographique, ou plus récemment, par des caméras CCD qui restituent une image numérique (On désigne sous le terme d’image numérique toute image (dessin, icône,...) du transfert de western . L'image est analysée par densitométrie, qui évalue le taux relatif de marquage de la protéine, et quantifie les résultats en termes de densité optique (La densité optique ou absorbance désigne le logarithme décimal de l'opacité, c'est-à-dire...). Des logiciels permettent une analyse plus poussée des données, comme l'analyse du poids moléculaire si les standards appropriés sont utilisés. Cette méthode appelée "détection améliorée de la chimiluminescence" ("enhanced chemiluminescent" - ECL) est considérée comme l'une des méthodes de détection les plus sensibles pour l'analyse des western blots.

Détection par autoradiographie

Le marquage radioactif ne nécessite pas de substrat enzymatique, mais permet l'utilisation de films utilisés en médecine (La médecine (du latin medicus, « qui guérit ») est la science et la...) pour l'imagerie (L’imagerie consiste d'abord en la fabrication et le commerce des images physiques qui...) à rayons X. Le film est directement placé sur le transfert de western, qui se développe lors de son exposition au marqueur et crée des régions sombres, lesquelles correspondent aux bandes de la protéine d'intérêt (cf. illustration). L'importance des méthodes de détection par radioactivité (La radioactivité, phénomène qui fut découvert en 1896 par Henri Becquerel sur...) est en déclin, du fait de son coût et de techniques plus sûres comme l'ECL.

Détection par fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l'excitation d'une molécule...)

La sonde couplée à l'anticorps est excitée par un rayon monochromatique (On qualifie de monochromatique (du grec mono-, un seul et chromos, couleur) une lumière dont la...) et l'émission qui en résulte est alors détectée par un photosenseur, par exemple une caméra CCD équipée des filtres en transmission appropriés, qui restitue une image numérique (Une information numérique (en anglais « digital ») est une information...) du transfert de western et permet une analyse plus fine telle que l'analyse du poids moléculaire ou quantitative du transfert de western. La fluorescence est considérée comme d'un niveau à peu près équivalent à la chimiluminescence pour l'analyse des transferts de western. Elle nécessite un outillage plus coûteux toutefois.

Différence entre fluorescence et chimiluminescence

Bien que de mécanisme photophysique similaire, chimiluminescence et fluorescence ne sont pas la même chose :

  • la fluorescence fait référence à l'excitation d'une molécule (Une molécule est un assemblage chimique électriquement neutre d'au moins deux atomes, qui...) depuis un état stable vers un état excité, et son retour à l'état basal par émission d'une radiation (Le rayonnement est un transfert d'énergie sous forme d'ondes ou de particules, qui peut se...) dans le spectre électromagnétique (Le spectre électromagnétique est la décomposition du rayonnement...) d'une longueur (La longueur d’un objet est la distance entre ses deux extrémités les plus...) d'onde (Une onde est la propagation d'une perturbation produisant sur son passage une variation...) donnée (Dans les technologies de l'information, une donnée est une description élémentaire,...), et spécifique de la molécule.
  • la chimiluminescence fait référence à la situation (En géographie, la situation est un concept spatial permettant la localisation relative d'un...) dans laquelle une molécule est formée dans un état excité, en tant que produit d'une réaction chimique (Une réaction chimique est une transformation de la matière au cours de laquelle les...), et retombe vers un état basal avec émission d'une radiation dans le spectre électromagnétique d'une longueur d'onde donnée.

Sondage secondaire

L'une des plus grandes différences entre les membranes en nitrocellulose et celles en PVDF est liée à leur capacité de supporter l'"arrachage" (stripping) d'anticorps et la réutilisation des membranes pour des sondages par d'autres anticorps. Bien qu'il existe des protocoles bien établis pour la réutilisation des membranes de nitrocellulose, le PVDF, plus épais, permet de réaliser ces manœuvres en toute sécurité et facilité, et davantage d'utilisations ultérieures avant d'être, tel un palimpseste, recouvert de "bruits" parasites. Une autre différence importance est que le PVDF, contrairement à la nitrocellulose, doit être trempé dans de l'éthanol à 95% ou de l'isopropanol avant usage (L’usage est l'action de se servir de quelque chose.). Les membranes en PVDF tendent aussi à être plus épaisses et plus résistantes aux dommages physiques liés à leur utilisation normale.

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