Spectrophotomètre - Définition

Présentation

Un spectrophotomètre UV-visible (« spectro UV ») est un appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution homogène à une longueur d'onde donnée ou sur une région spectrale donnée. Selon la loi de Beer Lambert, l'absorbance d'une solution est proportionnelle à la concentration des substances en solution, à condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle la substance absorbe les rayons lumineux. C'est pourquoi la longueur d'onde est réglée en fonction de la substance dont on veut connaître la concentration (doser dans le jargon des chimistes).

• d'après Beer Lambert, l'absorbance A_λ est fonction de la concentration C de la solution, du coefficient d'absorption molaire et de la longueur de solution à traverser L (en cm ! c'est pour cela que la plupart des cuves sont standardisées à L=1 cm).

où est la transmittance de la solution.

• On remarque que A_λ et sont fonction de la longueur d'onde de travail, elle est choisie en fonction des spectres d'absorbance.

Spectre d'absorbance de NAD⁺ et de NADH,H⁺ (wavelength=longueur d'onde)

Ici les deux spectres sont superposés, pour les réaliser indépendamment on a mesuré l'absorbance d'une solution de NAD⁺ (respectivement de NADH,H⁺) à différentes longueurs d'ondes (toutes choses égales par ailleurs).

La longueur d'onde d'absorbance maximale est ici λmax=260 nm pour les deux molécules, Il sera donc préférable de travailler à cette longueur d'onde. En revanche si on veut doser NADH,H⁺ lors d'une réaction enzymatique où le NAD⁺ est réduit en NADH,H⁺ par exemple, il est plus judicieux de travailler à λ=340 nm car ici on ne mesure que NADH,H⁺ car l'absorbance de NAD⁺ est nulle même si il est présent dans le mélange.

Cette notion n'est pas applicable aux spectrophotomètres Infrarouge (IR) qui sont essentiellement utilisés pour l’identification. On peut dire que, pratiquement, les spectros UV-visible sont utilisés pour des analyses quantitatives alors que les spectros IR sont des instruments qualitatifs. Tous deux utilisent les principes optiques semblables, mais le spectro IR balaye en fréquence l’échantillon.

Spectrophotomètre de laboratoire (ouvert).

Spectrophotomètre de laboratoire (fermé).

autre spectrophotomètre.

Le spectrophotomètre UV (Ultra Violet) comprend :

• une source ou des sources de lumière : lumière blanche pour mesure dans le spectre visible (lumière polychromatique) et/ou lumière UV.

La lampe UV est généralement de type deutérium, la lampe visible est généralement de type halogène, il existe également des spectrophotomètres à lampe xénon.

• un monochromateur formé d'un réseau diffractant la lumière de la source. Il permet de sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui traversera la solution à doser.
• une fente de largeur fixe ou variable pour régler la bande passante.
• un porte cuve pouvant permettre le maintien à température souhaitée de la solution à analyser, cette température est maintenue par un circuit d'eau ou un effet Peltier. Ce maintien à température fixée est très utile dans les mesures de cinétique enzymatique, en effet, la vitesse de réaction dépend de la température.
• une cuve transparente dans laquelle on place la solution à étudier. Suivant la qualité et la quantité d'échantillon, il existe différentes cuves, généralement en plastique (spectre visible, UV proche) ou en quartz (UV, mais cuves très chères). Le solvant utilisé n'étant pas toujours transparent, il est obligatoire de réaliser un « blanc » ou témoin de compensation, c'est-à-dire une mise à zéro du dispositif (tarer), en ne plaçant que le solvant utilisé dans la cuve avant la première mesure, et ce pour chaque longueur d'onde étudiée.

Les modèles de recherche sont généralement à double faisceau et utilisent deux cuves, une cuve de référence avec le solvant et la cuve échantillon avec le produit dans le solvant, le solvant est alors soustrait automatiquement (fonction auto-zéro).

• une cellule photoélectrique, restituant un courant proportionnel au nombre de photons reçus. Sur des modèles récents, le détecteur unique de type photodiode est parfois remplacé par une barrette CCD, ou une barrette de diode (chaque cellule sensible reçoit une couleur fixe). Les modèles les plus sensibles utilisent un détecteur de type photomultiplicateur ou PMT.
• un détecteur électronique dont la réponse est proportionnelle à ce courant électrique et permet une mesure relative de l'intensité lumineuse.

La spectrophotométrie est utilisée principalement pour connaître la concentration d'une solution colorée (procédé appelé dosage colorimétrique).