Ses premiers vols espions ont lieu en 1956. Le premier objectif était de repérer et photographier les sites de missiles stratégiques intercontinentaux.
Il devient célèbre le 1 mai 1960 lorsque un avion U-2 est abattu au-dessus de l'URSS, causant une tension extrême entre les Américains et les Soviétiques. Son pilote, Francis Gary Powers, est condamné à 10 ans de prison.
On retrouve aussi l'avion sur le devant de la scène en 1962, lors de la crise des missiles de Cuba, car c'est grâce aux photos qu'il ramène le 14 octobre que la preuve est faite à l'ONU de la présence de rampes de lancement de missiles sur l'île.
En 1981, les États-Unis mettent en service le TR-1, dérivé tactique plus grand, plus moderne et mieux équipé en électronique. En 1992, tous les U-2 et TR-1 reprennent la dénomination commune d'U-2 ou TU-2 (pour les biplaces). Par la suite, et au vu de sa vulnérabilité, son rôle diminue au profit du plus rapide SR-71 et, surtout, des satellites espion, plus discrets bien qu'ils soient beaucoup plus chers et moins souples à utiliser. Il dispose de capteurs optiques, électroniques et de radars qui lui permettent d'accomplir sa mission à haute altitude sans franchir la frontière.
Sur le plan administratif, la base aérienne de rattachement des U-2 est Beale Air Force Base depuis 1976. Cependant, un certain nombre d'avions ont été (voire sont toujours) déployés à l'étranger. On citera notamment :
- Osan Air Base en Corée du Sud
- RAF Alconbury et Fairford au Royaume-Uni
- Taëf en Arabie saoudite suite à la Guerre du Golfe (1990-1991)
- Base aérienne 125 Istres-Le Tubé en France (depuis décembre 1995, détachement d'avions précédemments déployés au Royaume-Uni pour les rapprocher de l'ex-Yougoslavie)
Enfin, quelques exemplaires ont été cédés à Taïwan (au moins 2 avions mi-1960 et 2 autres fin 1962), en plus des exemplaires utilisés par les américains depuis ce pays. Au moins 5 avions ont été abattus lors de missions d'espionnage au-dessus de la Chine.
