Les mégachiroptères sont surtout crépusculaires, ne se déplacent guère la nuit et se dirigent surtout grâce à leurs yeux et leur odorat.
Les microchiroptères sont nocturnes et se servent surtout de l'écholocation pour chasser et se repérer la nuit.
Les chauves-souris dorment en général 20 heures par jour, la tête en bas.
Les mégachiroptères se nourrissent de fruits, de fleurs et de pollen.
Les microchiroptères se servent de l'écholocation pour trouver leur nourriture. Leur régime alimentaire est très varié.
Les chauves-souris d'Europe sont exclusivement insectivores, ce qui explique en grande partie leur déclin. Leur régime alimentaire est identique à celui de l'hirondelle de cheminée ou du martinet noir : tout ce qui vole. Elles nous débarrassent de tonnes de moustiques chaque année. Lorsqu'elles tournent au-dessus de nos têtes, assez près souvent, c'est pour consommer le nuage de moucherons ou moustiques qui se développe au dessus de nous.
Certaines chassent en vol comme les pipistrelles ou les barbastelles, d'autres comme les rhinolophes chassent à l'affût, pendues à la branche d'un arbre.
Les chauve-souris d'Europe vivent dans des endroits remplis d’insectes l’été, mais déserts l’hiver. Elles doivent alors hiberner, en attendant des jours meilleurs dans des endroits à humidité fixe et chauds (en relatif par rapport à l'extérieur froid) comme les grottes, mais un vieux tronc ou une maison non chauffée feront l’affaire. Certaines aiment avoir de l’espace, d’autres au contraire s’entassent comme dans une boîte de conserve pour garder la chaleur. Elles baissent leur température de 38°C à 17 °C. La différence de température entre la cavité (tout au plus 10°C) et le corps (environ 17°C) provoque une condensation de l'humidité à la pointe des poils (rosée); si la condensation est trop importante la chauve-souris doit se réveiller et se lécher (ceci explique que pour éviter cela la chauve-souris choisit un taux d'hygromètrie lui convenant bien et présentant une stabilité certaine). La pulsation cardiaque descend à moins d'un battement par minute. Vers la fin de l’hiver certaines chauves-souris peuvent être atteintes de troubles du système nerveux, parfois mortel. Réveiller une chauve-souris en pleine hibernation risque fortement de la tuer (trop grosse consommation d'énergie pour voler, petit tour glacial dehors et absence de nourriture). Si vous découvrez une hibernante, reculez tranquillement sans bruit et laissez-la en paix.