Les symptômes classiques du botulisme surviennent le plus souvent entre 12 et 36 heures après l'ingestion de la toxine botulinique, mais ils peuvent parfois s'observer précocement dès la 6e heure ou tardivement après dix jours. Ils comportent le plus souvent une sécheresse de la bouche, des difficultés à avaler, une élocution incompréhensible, une vision double, des vomissements, une diarrhée importante, et surtout une faiblesse musculaire généralisée. S’ils ne sont pas traités, ces symptômes peuvent s’aggraver jusqu'à la paralysie des muscles des membres et du tronc (en particulier respiratoires), ce qui peut conduire au décès. Dans tous les cas c’est la toxine sécrétée par C. botulinum qui provoque la maladie, et non la bactérie elle-même.
Il existe des formes de botulisme par inoculation, liée à la pénétration volontaire ou involontaire d'une substance contaminée, souvent suite à l'injection intramusculaire ou intraveineuse d'une substance contaminée. Il peut en particulier s'agir de drogues telles que de l'héroïne de mauvaise qualité susceptible de provoquer de graves troubles nécessitant hospitalisation et ventilation artificielle. Dans ce dernier cas, les symptômes apparaissent dès six heures après l'injection et perdurent jusqu'à deux semaines. Ils peuvent être une vision dédoublée, des paupières lourdes, des confusions de langage ou d'élocution, des difficultés à avaler, une faiblesse bilatérale des bras, puis une paralysie flasque accompagnée de détresse respiratoire. Certains historiens soupçonnent également l'existence d'au moins un cas de botulisme provoqué par l'utilisation d'une arme antipersonnelle contaminée volontairement par la toxine botulique (de la toxine botulique mêlée à la couche de colle enduisant une grenade).
L’insuffisance respiratoire en cas de botulisme grave nécessite une ventilation mécanique (« respiration artificielle ») pendant plusieurs semaines en milieu de soins intensifs. Après plusieurs semaines, la paralysie s'améliore lentement. Diagnostiqué assez tôt, le botulisme alimentaire ou par blessure peut être traité par une antitoxine bloquant l'action de la toxine qui circule dans le sang. Cela peut empêcher l’état des patients de s’aggraver, mais la convalescence demandera toujours de nombreuses semaines. L'antitoxine n’est pas utilisée dans le traitement du botulisme infantile.
En cas de botulisme alimentaire on peut essayer d'évacuer les aliments contaminés qui se trouvent encore dans le tube digestif par des lavages gastriques ou des lavements. En cas de botulisme par blessure, la plaie responsable est traitée chirurgicalement pour faire disparaître la source des bactéries toxinogènes.
Par ailleurs chaque cas de botulisme crée une situation d’urgence pour la santé publique parce qu'il est nécessaire d'identifier la source de l’infection, et de s'assurer que toutes les personnes qui ont été exposées à la toxine ont été identifiées et qu’on a fait disparaître tous les aliments contaminés.
L'histoire clinique et les antécédents peuvent orienter le diagnostic, mais d'autres affections neurologiques avec déficits moteurs comme le syndrome de Guillain-Barré, les accidents vasculaires cérébraux et la myasthénie grave peuvent ressembler au botulisme, et doivent être écartées par des examens complémentaires. Ces tests peuvent comporter un scanner cérébral, un examen du liquide céphalo-rachidien (LCR), une électroneuromyographie (ENMG), et un test au Tensilon si l'on suspecte une myasthénie grave. L'ENMG est le test le plus utile au diagnostic, à condition de penser à réaliser une stimulation répétitive à haute fréquence qui donne un aspect d'incrément du potentiel moteur recueilli sur le muscle, spécifique d'un bloc de la jonction neuromusculaire de type pré-synaptique, c’est-à-dire par défaut de libération de l'acétylcholine dans la synapse. Cet aspect ne se retrouve que dans le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton une autre affection rare pouvant parfois poser des problèmes de diagnostic différentiel.
Le diagnostic formel du botulisme peut être confirmé par la présence de la toxine botulique dans le sérum ou les selles du patient dont l'injection à la souris reproduira les signes de la maladie. On peut aussi isoler la bactérie dans les selles des patients atteints de botulisme alimentaire ou infantile, ou par un prélèvement de la plaie infectée lors d'un botulisme par blessure.