Gommivore-insectivore-frugivore. Passe jusqu’à 32% de son activité journalière (et 67% de son temps alimentaire) à racler les troncs pour en prélever les sécrétions résineuses, ce qui fait de lui l’ouistiti le plus spécialisé dans la consommation de gomme. Il fait des incisions de 1 à 2cm qu’il visite quotidiennement et des chercheurs ont compté jusqu’à 1700 nouvelles incisions en six mois sur une aire donnée, ce qui profite au tamarin à selle (Saguinus fuscicollis). Au Pérou, l’ouistiti pygmée saigne l’écorce de près de 60 espèces de plantes appartenant essentiellement à quatre familles : anacardiacées, méliacées, légumineuses et vochysiacées. Il ponctionne les sapotiers chupachupa (Quararibea sp.), le pau-terra (Qualea sp.), le cèdre quaruba (Vochysia sp.) et le mombin jaune (Spondias mombin). Au sud de la Colombie, ses sources préférées sont les cèdres acajou (Cedrela sp.), les ingás (Inga sp.) dont il consomme aussi les fruits, les parkias (Parkia sp.), les clusias (Clusia sp.), le caballeros (Souroubea guianensis) et le figuier jípeo (Ficus hartwegii). Raffole aussi des arthropodes qu’il recherche dans la couronne des petits et moyens arbres ainsi que dans les enchevêtrements de lianes, toujours au-dessous de 20 m de hauteur. N’hésitera pas à s’aventurer dans un pâturage pour capturer des sauterelles. Parfois, grignote un fruit, lèche du nectar durant la saison sèche, croque un œuf d’oiseau ou s’attaque à un oisillon. En captivité, on a observé un spécimen chasser furtivement un oiseau, le tuer puis en consommer le cerveau riche en protéines.
En captivité, les copulations ne durent que 4 à 10 secondes mais le mâle se rattrape en toilettant longuement sa partenaire, parfois près d’une heure. La femelle met bas deux fois par an, pour la première fois autour de son 23ème mois. Elle connaît un second œstrus post-partum 3 secondes semaines après la mise bas. En Amazonie péruvienne, on enregistre deux pics de naissance, en mai-juin et entre octobre et janvier. Deux faux jumeaux naissent après 4-5 mois de gestation. Les naissances uniques représentent 30% des cas et les triplés sont très rares. Chaque bébé pèse 14 à 27 g à la naissance.
Jusqu’au vingtième jour, la femelle transporte les jumeaux sur son dos puis c’est au tour du mâle d’en assurer la charge toute la journée, il ne les rend alors à la mère que pour l’allaitement. Tous les membres du groupe sont des transporteurs potentiels. Les enfants sont parfois laissés seuls sur une branche. À 1 mois, les jumeaux réalisent leurs premiers jeux solitaires (exploration, acrobaties, sauts et mimes de capture d’insectes), ils commencent à être laissés seuls en des lieux sûrs. Pour le jeune ouistiti pygmée, le sevrage débute vers 1 mois et demi, autour de 5 mois il peut saigner les troncs lui-même. Les jumeaux passent beaucoup de temps à jouer ensemble lors des deux pauses quotidiennes, évoluant près de la cime. La mortalité infantile est de 33%, la plupart des décès intervenant durant les deux premiers mois. Sexuellement mature entre 12 et 18 mois, mais atteint sa taille adulte à 2 ans
Jusqu’à 18 ans en captivité.
Quadrupède. Saut-accrochage vertical. Bond jusqu’à 4 m. Grimper en spirale autour des troncs. Progresse soit lentement soit à toute vitesse.
Il est diurne et arboricole.