Avec la prise de pouvoir d'Adolf Hitler, s'ouvrit un chapitre noir de l'histoire de l'Université. Usant d'accusations calomnieuses et de poursuites judiciaires, les Nazis entreprirent une campagne de diffamation des savants et des étudiants juifs. Les cours des enseignants juifs furent boycottés, leurs auditeurs furent victimes d'agressions. La participation d'étudiants et d'enseignants à des autodafés, à partir du 10 mai 1933, marque tout particulièrement d'infamie une Université d'une telle réputation scientifique. Dans les mois et les années qui suivirent, environ un tiers des collaborateurs de l'Université furent renvoyés par les Nazis. Sur la base de la loi d'aryanisation de la fonction publique, plus de 250 professeurs et employés juifs se virent interdire en 1933/34 d'enseigner ou de travailler, de nombreux docteurs furent déchus de leur titre (ainsi Julius Pokorny, entre autres). Beaucoup de savants et d'étudiants durent fuir pour toujours l'Université de Berlin, qui ne méritait plus du tout son nom d' Alma Mater, elle qu'on avait si longtemps considérée comme le temple de la pensée humaniste.
L'Université et la vie intellectuelle allemande resteront marquées à jamais par l'expulsion et l'assassinat de savants et d'étudiants juifs, ainsi que d'opposants politiques au National-socialisme, d'autant plus que les Nazis ne rencontrèrent guère de résistance à leurs entreprises dans les milieux universitaires.
En 1949 l'ancienne université berlinoise de l'allée Unter den Linden reçut le nom de Humboldt-Universität zu Berlin (Université Humboldt de Berlin). En se plaçant ainsi sous l'égide des deux érudits – les frères Wilhelm et Alexander von Humboldt – l'université faisait mine de se réclamer des idéaux sublimes de l'humanisme et du libre épanouissement du savoir. Mais les conditions politiques et sociales de l'époque interdirent même la moindre mise en pratique.
En effet, les fondamentaux politiques de la RDA, fondée en 1949, donnèrent progressivement leur orientation aux contenus d'études, aux cursus, et aux conditions de la recherche. Grâce à la détente en Europe, qui commença au milieu des années 1970, l'Université Humboldt put à nouveau trouver un rôle dans le concert international, du moins dans certains domaines scientifiques, et le consolider par la coopération mondiale. Soulignons ici les relations, durables et intensives, que l'Université développa dans le domaine de la recherche, ainsi que les échanges avec les établissements supérieurs, en Europe de l’Est et en Europe centrale. Tout particulièrement avec des établissements de l'ancienne Union Soviétique. Mais il y eut aussi à la même époque des relations de coopération intensive avec des universités nord-américaines et japonaises, ou encore avec des pays en voie de développement, en Asie, Afrique et Amérique latine.
L'Université Humboldt était la plus grande université de RDA. Jusqu'en 1990, près de 150 000 étudiants y furent formés. Des chercheuses et des chercheurs d'une renommée internationale y enseignèrent. Beaucoup surent préserver leur rang dans le monde académique même après la réunification. Néanmoins, la plupart furent congédiés.
Dans l'Allemagne de l'après-guerre, les idéologies et les projets politiques divergents des Alliés conduisirent à des dissensions, qui donnèrent naissance à la guerre froide entre l'Est et l'Ouest. Pour cette raison, le communisme exerça une influence toujours plus forte sur l'Université. Contrairement à ce qui s'était passé sous Hitler, cela ne fut pas sans entraîner des réactions, et il y eut de fortes protestations parmi les étudiants et le corps professoral. Le pouvoir riposta entre autres par l'arrestation de nombreux étudiants par la police secrète soviétique, le NKVD, en mars 1947. Le tribunal militaire soviétique de Berlin-Lichtenberg leur infligea vingt-cinq ans chacun de travaux forcés, sous prétexte d' « agitation souterraine au sein de l'Université de Berlin », ou encore sous l'allégation d'espionnage. Aussi, dès la fin de l'année 1947, des voix s'élevèrent pour réclamer une université libre. Dix-huit étudiants et enseignants furent arrêtés ou déportés entre 1945 et 1948, beaucoup d'autres disparurent pendant des semaines. Quelques uns furent mêmes enlevés et jugés en URSS. Au printemps 1948 la direction de l'Université interdit d'études de nombreux étudiants, cela sans même passer par une procédure juridique. Une partie des professeurs et des étudiants fit alors scission de l'Université de Berlin, et fonda l'Université libre de Berlin. On se retira dans le secteur d'occupation américain à Dahlem, dans le bâtiment de l'ex-Société Kaiser Wilhelm. La devise latine « Veritas - Iustitia - Libertas » (Vérité, Justice, Liberté) marquait la distance idéologique à l'égard de la vieille université berlinoise dominée par le Communisme. En même temps, un sceau archaïsant permit de se rattacher à la tradition (l'ours berlinois avec le flambeau de la liberté). La division de la ville entre l'Est et l'Ouest dura des années, et elle finit par pérenniser la scission entre les deux universités, autonomes de fait.