Jusqu'au XIXe siècle, l'aqueduc était long de 12 936 mètres, entre le regard Louis-XIII de Rungis (regard n°1) et le château d'eau de l'Observatoire à Paris (regard n°27). Il traversait successivement les communes de Fresnes, L'Haÿ-les-Roses, Cachan, Arcueil, Gentilly (toutes situées dans le Val-de-Marne) puis les 14e et 6e arrondissements de Paris. Sur une partie de son tracé, il suit en surplomb la vallée de la Bièvre, d'abord sur sa rive droite, puis à partir d'Arcueil sur sa rive gauche. Il est intéressant de noter qu'il suit un parcours très proche de celui de l'aqueduc de Lutèce construit 1500 ans plus tôt, lequel se trouvait à une altitude légèrement inférieure.
Sous le Second Empire, la partie parisienne de l'aqueduc est déclassée : à partir du boulevard Jourdan, les eaux sont dirigées directement sous la rue de la Glacière vers les réservoirs du Panthéon, construits en 1843 sur la montagne Sainte-Geneviève. Depuis la suppression de ceux-ci, en 1904, elles sont déversées dans le lac du parc Montsouris. L'aqueduc ne mesure donc maintenant plus que 10 420 mètres.
Contrairement aux aqueducs construits à partir du Second Empire, le tracé de l'aqueduc n'est pas matérialisé en surface, la Ville de Paris n'étant pas propriétaire du sol traversé.Il traverse en souterrain les propriétés privées, qui sont soumises à une zone de servitude s'étendant à 30 mètres de part et d'autre de celui-ci : les constructions et plantations y sont soumises à autorisation, et les fosses septiques, cuves à mazout, dépôts de produits toxiques et de fumier strictement prohibés.
L'eau circule dans une galerie d'environ de 1 mètre de large et 1,80 mètre de hauteur, formée d'une voûte en plein cintre reposant sur deux murs en meulière et caillasse liées par du mortier, avec chaînages de pierres de taille régulièrement espacés. Le sol constitué de deux banquettes séparées par une cunette de section carrée d'environ 40 centimètres de côté. Le tout est situé à quelques mètres en-dessous du niveau du sol (maximum 15 mètres, entre Rungis et Fresnes). L'eau ne coule librement dans la galerie que jusqu'au regard n°10 (à Cachan). Au-delà, elle circule dans une conduite en fonte installée lors du raccordement de l'aqueduc aux réservoirs du Panthéon, dont l'altitude ne permettait plus un simple écoulement gravitaire.
La galerie n'a jamais été reconstruite, sauf ponctuellement : une courte section à Cachan par suite d'un glissement de terrain au début du XIXe siècle, deux siphons au niveau des tranchées des autoroutes A86 à Fresnes et A6 à Arcueil (respectivement en 1990 et 1960), et une déviation au début des années 2000 contournant le parc Médicis à l'est de Fresnes. A Paris, l'ancienne galerie déclassée a été coupée en plusieurs endroits, notamment lors du percement de l'avenue Reille, de la rue d'Alésia et de l'avenue René-Coty. Certains tronçons ont cédés à des riverains et transformés en caves, voire en abris anti-aériens.
Les regards jalonnent en surface le parcours de l'aqueduc. Ce sont des édicules qui permettent un accès réservé à la galerie souterraine, via un escalier. Au leur niveau, l'eau passe par un bassin dont la finalité est de favoriser l'oxygénation de l'eau et le dépôt des impuretés. Quelques-uns, autrefois édifiés en plein champ, se sont retrouvés enclos dans des propriétés privées ; la plupart se trouvent cependant sur la voie publique. Ils sont complétés à intervalles beaucoup plus rapprochés par 258 trappes de visite.
La partie encore en service de l'aqueduc compte 21 regards. Seuls les n°16 (à Arcueil) et n°21 (au niveau de la Cité universitaire) n'existent plus en surface. Les plus importants, les n°1 à Rungis (dit « regard Louis XIII »), n°3 à Fresnes et n°13 à Arcueil sont classés monuments historiques.
L'ancienne partie parisienne comptait quant à elle 6 regards. Il faut citer en premier lieu le château d'eau de l'Observatoire (n°27), aujourd'hui connu sous le nom de « maison du Fontainier » (rue Cassini, dans le 6e arrondissement). Ce bâtiment avait une double fonction : en surface, le logement du fontainier du roi (responsable entre autres de l'aqueduc), en sous-sol la répartition des eaux entre les trois bénéficiaires : le Roi, la Ville, l'Entrepreneur. Ce dernier se rémunérait en vendant des concessions, c'est-à-dire des fractions de débit, à des institutions ou des particuliers fortunés, aussi bien à Paris qu'au voisinage de l'aqueduc en banlieue. Le château d'eau fut complété par un réservoir souterrain en 1845. Remise par le Service des Eaux à la disposition de la municipalité en 1866, elle fut occupée par le couvent du Bon-Pasteur. Classée monument historique, elle a été restaurée.
Des autres regards parisiens, il ne subsiste que les numéros 25 (dans l'enceinte de l'hôpital La Rochefoucauld, visible depuis l'avenue René-Coty) et 26 (dans les jardins de l'Observatoire). Le n°23, recouvert de remblais lors de la construction des ateliers du chemin de fer de Sceaux, fut dégagé en 1996 par les travaux de la ZAC Alésia-Montsouris, puis démoli et remplacé par une copie du n°25.
C'est le seul ouvrage d'art de surface que compte l'aqueduc Médicis. Il lui permet de franchir la vallée de la Bièvre à un endroit où elle se resserre. Suivant grossièrement la limite des communes d'Arcueil et de Cachan, il occupe à peu de chose près l'emplacement du pont de l'aqueduc de Lutèce, construit à l'époque gallo-romaine, et dont il ne reste aujourd'hui que quelques ruines. Ce sera aussi le site choisi à la fin des années 1860 pour le passage de l'aqueduc de la Vanne dont les piles s'enracinent au sommet de notre aqueduc.
Long de 379 mètres, d'une hauteur maximale de 18,86 mètres, il est l'œuvre de Thomas Francine et de Louis Métezeau. Il se divise en 3 parties : 2 massifs en maçonnerie encadrant la partie centrale constituée de 18 travées, dont 9 sont ouvertes d'une arcade en plein cintre. Le pont est limité à l'est par le regard n°13 et à l'ouest par le regard n°14.
Il est classé monument historique.