Le virus est transmis par les moustiques vecteurs, et en particulier les Culex, qui sont les principaux vecteurs du virus du Nil occidental, lorsqu’ils piquent les oiseaux et les infectent. Tous les facteurs favorisant la pullulation des moustiques (pluies abondantes, irrigation, températures plus élevées que la normale...) sont susceptibles d'augmenter l'incidence de la fièvre liée à ce virus dans les secteurs géographiques où il circule.
Les principaux hôtes sont les oiseaux, qu'ils soient sauvages ou domestiques (canards, pigeons...), car ils jouent un rôle crucial dans la dissémination de ce virus. Les oiseaux migrateurs permettent notamment le passage du virus de l'Afrique aux zones tempérées d'Europe et d'Asie au printemps. Une fois arrivés, les moustiques locaux s'infectent lorsqu'ils piquent ces oiseaux pour leur repas de sang, disséminant sur d'autres oiseaux sains le virus et perpétuant le cycle moustiques/oiseaux essentiel à la circulation du virus.
Les oiseaux sont des hôtes amplificateurs, développant une charge virale suffisante pour transmettre l'infection à d'autres moustiques piqueurs qui vont infecter d'autres oiseaux (dans l’hémisphère ouest, le merle d'Amérique et la corneille d'Amérique sont les porteurs les plus fréquents) ainsi que les êtres humains. Les espèces de moustiques infectés varient selon les zones géographiques, aux Etats-Unis Culex pipiens (Est des États-Unis), Culex tarsalis (Middle Ouest et Ouest) et Culex quinquefasciatus (Sud-Est) sont les principales sources de contamination.
Les mammifères (bétail, chiens, chats, chevaux, humains ...) sont quant à eux considérés comme des hôtes accidentels du virus.
Chez les mammifères, le virus ne se multiplie pas aussi facilement (à savoir qu’il ne développe pas une virémie élevée lors de l'infection), et on croit que les moustiques piquant les mammifères infectés n’ingèrent pas une quantité de virus suffisante pour être infectés, faisant des mammifères ce qu’on appelle une impasse pour l'infection.
Un article paru 2004 dans Science a révélé que les moustiques Culex pipiens étaient répartis en deux populations en Europe, une qui pique les oiseaux et une qui pique l'homme. En Amérique du Nord 40% des Culex pipiens se sont révélés être des hybrides des deux types, ceux qui piquent les oiseaux et ceux qui piquent les humains, fournissant ainsi un vecteur pour le virus du Nil Occidental. Ce fait est censé fournir une explication des raisons pour lesquelles la maladie du Nil occidental s'est propagée plus rapidement en Amérique du Nord qu'en Europe. Toutefois, ces conclusions ont été contestées.
On a d’abord cru que transmission directe d’homme à homme ne se rencontrait qu’à la suite d’une exposition professionnelle, ou d’une projection de sang infecté sur les conjonctives. La flambée survenue aux États-Unis a révélé de nouveaux modes de transmission, par la transfusion sanguine, la transplantation d'organe,l’exposition intra-utérine du foetus, et l'allaitement.
Les infections par le virus du Nil Occidental les plus graves sont clairement associées à un âge avancé et aux antécédents du patient, transplantation d'organes et diabète. Un facteur génétique semble également augmenter la susceptibilité à la maladie du Nil occidental. Une mutation du gène CCR5 donne une certaine protection contre le VIH, mais conduit à une plus grande susceptibilité aux complications les plus graves au cours d'infection par le virus du Nil Occidental. Les porteurs de deux copies mutées du CCR5 représentaient 4 à 4,5% d'un échantillon de personnes souffrant de la maladie du Nil occidental, tandis que la fréquence du gène dans la population générale n'est que de 1%.
Récemment, le potentiel infectant de la salive des moustiques pour la transmission du virus du Nil Occidental a été démontrée. Les moustiques inoculent leur salive dans la peau tout en aspirant le sang. La salive des moustiques est un cocktail pharmacologique de molécules, principalement des protéines, qui peuvent affecter la constriction vasculaire, la coagulation sanguine, l’agrégation plaquettaire, l’inflammation et l’immunité. Il est devenu clair que la salive de moustiques modifie la réponse immunitaire d'une manière qui peut être favorable au virus. des études ont montré qu'il peut moduler spécifiquement la réponse immunitaire au début de l’infection virale,et le processus d'alimentation du moustique peut aggraver l'infection par le virus débouchant sur un accroissement de la virémie et l’évolution vers des formes plus sévères de la maladie. On ne sait pas quel est l'avantage, le cas échéant, que le moustique retire en aidant ainsi le virus, il est donc probable que le virus exploite tout simplement les qualités préexistantes de la salive du moustique développées à d'autres fins.
On ne dispose pas de vaccin pour les humains. Il existe un vaccin pour les chevaux préparé à partir de virus tués et certains Zoos ont administré ce vaccin à leurs oiseaux, mais son efficacité n’est pas encore démontrée. Les chiens et les chats montrent peu ou pas de signes d'infection. Il n'existe aucun cas connu de transmission directe du chien ou du chat à l'homme, bien que ces animaux puisent être infectés, il est peu probable qu'ils soient à leur tour capables d'infecter des moustiques indigènes, perpétuant ainsi le cycle de la maladie.
Eviter les piqûres de moustiques est le moyen le plus simple de prévenir l'infection : rester à l'intérieur (tout en empêchant les moustiques d’entrer), à l'aube et au crépuscule, porter des vêtements de couleur qui couvrent les bras et les jambes ainsi que le tronc, utiliser un répulsif sur la peau et les vêtements (comme le N,N-diéthyl-3-méthylbenzamide, la picaradine, ou l'huile de corymbia citriodora pour la peau et la perméthrine pour les vêtements). Si l'on est infecté, en général, le traitement est purement symptomatique : analgésique contre la douleur en cas d’atteinte neurologique, réhydratation en cas de nausées, de vomissements ou de diarrhée; l’encéphalite peut également nécessiter une protection des voies respiratoires et la prévention des crises convulsives.
Le nombre de cas signalés aux Etats-Unis en 2005 a dépassé celui de 2004 et le niveau de 2006 a dépassé celui de 2005. Le 19 août , 2006, le Los Angeles Times a rapporté que le taux d'incidence attendue de la maladie du virus du Nil Occidental chutait au fur et à mesure que la population locale était davantage exposée au virus. "Dans des pays comme l'Egypte et l'Ouganda, où le virus du Nil occidental a été détecté pour la première fois, les gens ont été pleinement immunisés contre le virus au moment où ils ont atteint l'âge adulte", selon les autorités sanitaires fédérales. Toutefois, quelques jours plus tard, le CDC déclarait que le virus du Nil occidental pourrait atteindre un niveau élevé au bout de trois ans parce que l’élévation des températures avait permis l’éclosion d’une quantité plus importante de moustiques.