Cyanotoxine - Définition

Analyses des cyanotoxines

Les méthodes d’analyses peuvent être départagées en méthodes de criblage qui sont généralement très sensibles mais peu sélectives et en méthodes de confirmation qui sont très sélectives et présentent une sensibilité appréciable. Parmi les méthodes de criblage, on retrouve les bio-essais sur différents organismes, la méthode immunologique ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) et différentes méthodes enzymatiques utilisant les propriétés biochimiques des cyanotoxines. Les méthodes de confirmation sont principalement des variantes de la chromatographie liquide haute performance couplée avec différentes méthodes de détection dont la plus performante est la spectrométrie de masse, qui elle-même présente une pluralité de types d’analyseurs.

Préparation des échantillons

Un obstacle important aux méthodes d’analyse est la préparation de l’échantillon. En effet, mis à part pour les bio-essais où la préparation ne requiert que la lyse des cellules de façon à extraire les toxines intracellulaire, il est souvent nécessaire de se débarrasser de plusieurs substances pouvant créer des interférences et/ou de pré-concentrer les molécules d’intérêt.

Lyse et Extraction

Les cyanotoxines sont dissoutes dans la matrice liquide ou bien sont piégées à l’intérieur des cellules. Il est utile, voire nécessaire, de départager les échantillons en fonction de la matrice qui contient les toxines. Par filtration et centrifugation, on peut séparer les fractions solides, c'est-à-dire les cellules de cyanobactéries, de la matrice aqueuse constituant la fraction liquide.

Différentes techniques de lyses de la fraction solide sont utilisées comme le gel-dégel, la lyophilisation et la sonication (aussi nommée l’ultrasonication). D’autres protocoles utilisent une procédure de lyse/extraction simultanée, comme par exemple l’extraction dans un solvant en ébullition et l’utilisation d’un micro-onde, qui permet d’effectuer une extraction de type Soxhlet. L’utilisation d’une extraction liquide pressurisée à température élevée est aussi utilisée.

Présentement, aucun solvant n’est universel pour l’extraction de l’ensemble des cyanotoxines, dû aux différentes structures moléculaires qui présentent un caractère hydrophobe ou polaire variable. De plus, le pH de la solution d’extraction est un paramètre qui est pour l’instant peu compris mais qui a fort probablement un impact sur la solubilité des composés vu les groupements ionisables présents dans la majorité des cas.

Le tableau suivant présente les solvants qui sont majoritairement utilisés pour l’extraction des grandes classes de cyanotoxines. Mis-à-part pour les microcystines, les autres solvants ne sont pas validés et font objet de proposition. Les conditions d’extraction des microcystines s’appliquent vraisemblablement aux nodularines qui sont des analogues structuraux des microcystines.

•  % de méthanol varie entre 50 et 75 %
  •  % méthanol = 25 % et pH =3 (acide acétique)

Purification et pré-concentration

Un problème inhérent à l’extraction, est la co-extraction d’interférant générant un échantillon qui devient rapidement complexe. De plus, les fractions liquides, généralement aqueuse, ont une concentration très faible en cyanotoxines dissoutes. Par conséquent, il faut purifier les molécules d’intérêt avant de procéder à leur quantification ou bien concentrer celles-ci de façon à dépasser les limites de quantification de l’appareil d’analyse.

Ces deux objectifs peuvent être atteints par le biais de l’extraction sur phase solide qui est la méthode la plus utilisée. Dans cette technique, on fait passer la solution au travers d’une cartouche rempli de particules et on élue avec un solvant adéquat nos analytes d’intérêts qui ont été adsorbés sur la phase solide. La phase solide la plus courante est une phase greffée C₁₈ qui permet de retenir efficacement les microcystines et les nodularines. Cependant, cette phase solide est peu sélective pour les autres cyanotoxines qui sont plus polaires. Récemment, une étude a démontrée les capacités de rétention des cartouches qui utilisent du charbon noir sous forme de graphite. Cette phase solide agit principalement comme une phase greffé C₁₈, mais lorsqu’utilisée sous certaines conditions elle peut agir comme échangeur d’ions cationiques.

Une autre méthode chromatographique de purification et de pré-concentration des microcystines utilisent les principes d’immunoaffinité. À l’aide d’anticorps polyclonaux ou monoclonaux ajouté au support solide, on peut sélectivement retenir les molécules d’intérêt et les éluer par la suite.

Méthodes de criblage

Les essais sur animaux ont longtemps été la méthode de détection de la toxicité des efflorescences. Évidemment, ces méthodes sont pauvres en sélectivité et en sensibilité. Ces tests ne sont maintenant utilisés que pour comprendre le mécanisme d’action des toxines et tenter de dériver des normes au niveau des doses maximales tolérables quotidiennes.

Méthodes biochimiques

La détection des microcystines et des nodularines peut s’effectuer à l’aide de leur activité biochimique qui est en lien avec leur mécanisme de toxicité. Ces molécules sont des inhibiteurs de protéines de types phosphatases (PP1 ou PP2A) qui exécutent la déphosphorylation de phosphoprotéines intracellulaires. Il s’agit de mesurer l’activité d’une quantité fixe de phosphatases, en fonction de différentes concentrations de microcystines/nodularines, avec une quantité fixe de substrat. Initialement, le substrat utilisé était un radio-isotope du 32P, mais des variantes utilisant un substrat détectable par spectrophotométrie ont été développées pour pallier les problèmes reliés à l’utilisation de matériel radioactif.

Un test semblable s’applique pour la détection de l’anatoxine-a(S) par le biais de son activité sur l’enzyme acétylcholinestérase. Ce test n’est pas exclusif à cette toxine car les pesticides organophosphorés exhibent le même pouvoir d’inhibition.ref>Agence française de sécurité sanitaire de l’environnement et du travail (AFSSET), Évaluation des risques liés à la présence de cyanobactéries et de leurs toxines dans les eaux destinées à l’alimentation, à la baignade l’eau de baignade et aux autres activités récréatives, juillet 2006.. Finalement, les saxitoxines peuvent être détectées à l’aide de leur activité biologique où ils agissent comme agent bloqueur des canaux sodium de la membrane cellulaire. Le test s’effectue par l’incubation de ces neurotoxines avec des cellules cancéreuses de type neuroblastes, qui démontrent l’expression génétique de canaux à sodium, et de deux agents qui favorisent l’ouverture et le processus de retour du sodium hors de la cellule. Ceci permet de maximiser l’activité de ces canaux et d’améliorer la sensibilité du test. Après la période d’incubation, on mesure le taux de survie des cellules par colorimétrie en fonction de la concentration de saxitoxines.

Méthodes immunologiques

Ces méthodes sont du type ELISA et elles sont basées sur le principe de reconnaissance de motifs structuraux présents sur une molécule définie, par des anticorps. La technique est de type compétition directe, où il se produit une compétition pour le site actif de l’anticorps entre une microcystine conjuguée à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) et une microcystine contenu dans l’échantillon à analyser. Après le temps d’incubation, le substrat est ajouté et la concentration de microcystines-enzyme liées aux anticorps est évaluée par spectrophotométrie. Une coloration intense indique une faible quantité de microcystines libres dans l’échantillon et l’inverse implique une forte concentration de microcystines.

Méthodes de confirmation

Ces méthodes sont exclusivement des techniques chromatographiques couplées à une gamme d’analyseurs tels la détection du rayonnement UV-visible, l’émission de fluorescence et l’enregistrement du spectre d’absorption avec des barrettes de diode (PDA), ainsi que les différents analyseurs utilisés en spectrométrie de masse (SM). Les techniques chromatographiques incluent les variantes de la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), de la chromatographie en phase gazeuse (CG) et de l’électrophorèse capillaire (EC). Les variantes de la SM sont attribuables aux techniques d’ionisation des analytes et des détecteurs utilisés. Les techniques d’ionisation sont l’électronébulisation (ESI), le bombardement par atomes rapides (FAB) et l’ionisation-désorption laser assistée par matrice (MALDI), alors que le triple quadripôle (QqQ) ainsi que le temps de vol (TOF) sont utilisés comme analyseur.

Les méthodes de CLHP sur phase inversée utilise une phase stationnaire C₁₈ hydrophobe qui retient en ordre décroissant les microcystines et nodularines, les anatoxines, les cylindrospermopsines et les saxitoxines. Ces dernières sont peu ou pas retenues et un agent de pairages d’ions est souvent ajouté pour augmenter la rétention de celles-ci Les saxitoxines sont mieux séparées en CLHP sur phase normale avec une phase stationnaire constituée de silice et de groupement amide libre.

Les méthodes de détection basée sur le rayonnement nécessitent la présence de groupements chromophores sur les molécules. Dans certains cas, il faut effectuer une dérivation pré ou post-colonne de façon à ajouter un groupement chromophore à l’analyte, c’est le cas des saxitoxines qui sont détectées par fluorescence.

Les méthodes de SM utilisent majoritairement l’ESI comme méthode d’ionisation et la détection s’effectue avec le triple quadripôle qui est une méthode de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Le triple quadripôle permet différents modes d’acquisition de spectres en fonction du patron de fragmentation désirés. On retrouve, le « multiple reaction monitoring » (MRM), le « precursor ion mode » et le « selected ion monitoring » (SIM). Cet ensemble de méthodes permet d’obtenir la sélectivité nécessaire pour détecter les analogues structuraux des différentes classes de cyanotoxines grâce au patron de fragmentation.

Une autre méthode d’analyse utilise un produit de dégradation des microcystines et des nodularines résultant d’une oxydation. Ce produit est analysé par CG/SM ou CLHP et détecté par fluorescence après avoir effectué une dérivation post-colonne. Cette méthode a été développé dû au fait que dans les matrices animales, les hépatotoxines sont liées de façon covalente aux phosphatases, et c’est seulement celles qui sont libres qui sont détectées. Par conséquent, une procédure d’oxydation au permanganate de potassium et du métapériodate de sodium permet de libérer l’acide carboxylique MMPB (acide 2-méthyl-3-méthoxy-4-phénylbutyrique) de l’acide aminé ADDA.

Les méthodes d’EC utilisent la mobilité d’une molécule chargée soumise à un champ électrique. Comme les cyanotoxines sont sous forme anioniques ou cationiques en fonction du pH de la matrice aqueuse, il est possible de les séparer par EC et de les détecter par UV-vis ou SM. Une variante intéressante utilise l’ajout d’un surfactant à la matrice aqueuse et celui-ci agit comme phase pseudo-stationnaire. La séparation est dû aux différences de solubilisation des molécules à l’intérieur des micelles du surfactant et de la mobilité électrophorétique.

La spectrométrie MALDI-TOF est en plein développement car elle ne nécessite pas la séparation du mélange au préalable par CLHP. De plus, cette méthode permet l’utilisation d’une très faible masse d’échantillon, et comme le triple quadripôle, on peut effectuer un balayage des ions produits (post source decay PSD) qui permet de détecter les fragments d’intérêts. Cependant, cette méthode provoque un bruit de fond important en fonction de la matrice qui est utilisée.

Avantages et inconvénients des méthodes

Le tableau suivant présente les limites de détection pour plusieurs méthodes analytiques.

Les bio-essais sur les animaux ont l’avantage de détecter l’ensemble des cyanotoxines, mais ne démontrent que très peu de sélectivité face aux classes de cyanobactéries et encore moins pour différencier les variantes structurales à l’intérieur d’une même classe. De plus, la présence de résultats faux-positifs n’est pas négligeable et la reproductibilité des résultats est faible. Malgré cela, ces tests présentent la possibilité de détecter la totalité des cyanotoxines, incluant les cyanotoxines inconnues qui pourront par la suite être investiguées avec des méthodes de confirmation de façon à déterminer leur structure.

Les méthodes chromatographiques démontrent la plus grande sélectivité et la meilleure quantification des différentes variantes des cyanotoxines. La détection du rayonnement est moins performante au niveau de la quantification, vu la plus faible sensibilité et sélectivité comparativement à la SM. Il est également à la portée des procédures de SM de déterminer la structure exacte des nouvelles toxines. Le manque de standards certifiés est présentement l’inconvénient majeur de l’ensemble de ces techniques qui fait en sorte que l’on ne détecte pas l’ensemble des cyanotoxines. De plus, les échantillons nécessitent une préparation préalable qui consomme du temps et génère un temps réponse relativement long.

Les méthodes immunologiques et biochimiques sont attrayantes vu la rapidité du temps réponse et la possibilité de détecter l’ensemble des variantes de la cyanotoxine étudiée. Cependant, ceci engendre nécessairement un manque d’information sur les variantes structurelles et dans le cas de l’ELISA, il y a un risque de réactivité croisée faisant en sorte qu’il est difficile de relier la concentration de microcystines détectées à la toxicité réelle de l’échantillon. De façon générale les méthodes utilisées dépendent de l’objectif à atteindre et des coûts associés aux analyses. Ainsi, les méthodes immunologiques et biochimiques démontrent une sensibilité comparable aux méthodes de confirmation, à un moindre coût, et sont des méthodes de choix pour les analyses de routines. De plus, les qualifications du personnel technique sont moins exigeantes que dans le cas des méthodes de confirmation. Ces dernières sont principalement utilisées dans le cadre de recherche et développement.